dc.contributor.author
Höhn, Britta
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:03:20Z
dc.date.available
2006-12-13T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3332
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7532
dc.description
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Problemstellung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Ausblick
Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
Anhang
dc.description.abstract
Unter Prionkrankheiten werden eine Reihe an fatalen, neurodegenerativen
Erkrankungen bei Menschen und Tieren wie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, BSE
oder Scrapie zusammengefasst. Die pathogene Form des Prionproteins (PrPSc)
stellt das infektiöse Agens und den einzigen zurzeit bekannten Marker der
Prionkrankheiten dar. PrPSc entsteht durch die Fehlfaltung und Aggregation des
wirtseigenen zellulären Prionproteins (PrPC) und lagert sich in Form von
Plaques hauptsächlich im Gehirn ab. Wegen der biochemischen Ähnlichkeit der
beiden Prionprotein-Isoformen konnten bisher keine präklinischen
Diagnoseassays entwickelt werden, die verlässlich zwischen den Konformationen
unterscheiden können. In dieser Arbeit wurden deshalb drei verschiedene
Strategien verfolgt, um PrPSc-spezifische Aptamere zu generieren: (i)
Selektion gegen pathogenes PrP27-30, das aus infizierten Hamsterhirnen
isoliert wurde, (ii) Selektion gegen ausgewählte konformationsspezifische
Epitope von PrPSc in Form von Peptid-Targets und (iii) Selektion gegen in
vitro aggregierte, lösliche PrP-Oligomere. Natives PrP27-30 war wegen seiner
Inhomogenität nicht als Target für eine in vitro Selektion geeignet. Deshalb
wurden Peptide ausgewählt, von denen erwartet wurde, dass sie
konformationsspezifische Epitope auf der Oberfläche von PrPSc abbilden, aber
in PrPC maskiert vorliegen. Gegen ein Tyr-Tyr-Arg-Motiv der pathogenen
Prionkonformation konnten erfolgreich hochaffine und spezifische RNA-Aptamere
selektiert werden. Für diese Aptamere wurden Dissoziationskonstanten für das
Peptid im nanomolaren Bereich bestimmt. Durch Primär- und
Sekundärstrukturanalysen konnten minimale Bindungsmotive der Aptamere
definiert und der beste Binder Aptamer S3-20 so um 40 Nucleotide verkürzt
werden, dass die Affinität für das Peptid erhalten blieb. Die Aptamere waren
in der Lage an PrP-Oligomere, die als Modell für PrPSc verwendet wurden, mit
einem KD von 800 nM zu binden und zwischen den beiden Isoformen mit den Faktor
von zwei zu unterscheiden. Um die Spezifität der Aptamere weiter zu
verbessern, wurde zusätzlich eine Selektion gegen PrP-Oligomere durchgeführt,
wobei neue Aptamere mit einer Bindungskonstante im Bereich von 640-680 nM
isoliert werden konnten. Der Diskrimininierungsfaktor konnte auf einen Wert
von 5 erhöht werden. Diese isolierten Aptamere können als Ausgangspunkt für
weitere in vitro Evolutionen dienen, um höhere Affinitäten und Spezifitäten
gegen PrPSc zu erzielen.
de
dc.description.abstract
Prions are involved in the pathogenesis of the fatal neurodegenerative
disorders called transmissible spongiform encephalopathies (TSE) such as
scrapie in sheep, BSE in cattle and Creutzfeldt-Jakob-Disease in humans. The
pathogenic form of the prion protein (PrPSc) represents the infectious agent
and the currently only known marker for prion disease. PrPSc is caused by
misfolding and aggregation of the cellular prion protein (PrPC) and it is
stored as plaques and prion rods mainly in the brain. Because of the
biochemical similarity of the prion protein isoforms, the development of pre-
clinical diagnostic tests that could reliably discriminate between the
conformations has failed up to date. In this study, therefore, the following
strategies were employed to isolate PrPSc-specific aptamers by: (i) selection
against PrP27-30 that was isolated from infected hamster brains, (ii)
selection against conformation-specific epitopes by employing a peptide
approach and (iii) selection against in vitro aggregated, but soluble PrP-
oligomers. It turned out that PrPSc was no suitable target for in vitro
selection. This was likely due to its inhomogenity. Consequently, peptides
were designed to mimic the conformational epitopes of PrPSc which are masked
in PrPC. Highly affinic and specific aptamers against Tyr-Tyr-Arg-motif of
pathogenic prion protein were successfully isolated. The apparent dissociation
constants of these aptamers were determined in the nanomolar range. Binding
motifs could be defined by using primary and secondary structure analysis. The
best binder S3-20 was reduced to the minimal binding motif without loss of
affinity. The aptamers were also capable to bind to PrP-oligomers that were
used as a model for PrPSc with a Kd of 800 nM and to discriminate between the
two isoforms with a factor of two. However, the specificity of these aptamers
was not satisfactory. Therfore, an additional selection was performed and
novel aptamers were raised against PrP-oligomers. These aptamers exhibited
dissociation constants in the range of 640-680 nM and the discrimination
factor could be enhanced to 3 to 5. These isolated aptamers that will serve as
starting point for further cycles of in vitro evolution to achieve higher
affinity and specificity for PrPSc.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
prion SELEX aptamer diagnosis TSE
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Selektion und Charakterisierung von PrPSc-spezifischen Aptameren
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker A. Erdmann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gerd Multhaup
dc.date.accepted
2006-12-11
dc.date.embargoEnd
2006-12-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002435-9
dc.title.translated
Selection and characterisation of PrPSc-specific aptamers
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002435
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/651/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002435
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access