Phototoxic interactions of tattoo pigments with laser and natural light in vitro

Abstract

Tattooing, a process in which colorants are permanently embedded in human skin to generate long-lasting images, enjoys a high popularity nowadays. Today, every fifth to fourth person is tattooed. This popularity seems not to be affected by the high number of tattoo related side effects, which especially occur when tattooed skin encounters light. Light induced side effects make up to about 60 % of tattoo associated side effects. Consequently, the interactions of ultraviolet light and laser light on tattoo pigments and the resulting effects on human skin cells were investigated in this thesis to increase the understanding of photo-induced side effects found in tattoos. Firstly, we treated postmortem tattooed pig skin with laser used in tattoo removal. We consequently analyzed cleavage products using gas chromatographic separation coupled to mass spectrometric detection. 3,3’-dichlorobenzidine, a carcinogen produced through cleavage of Pigment Orange (P.O.)13, was found to be cytotoxic and genotoxic in terms of DNA double strand breaks in human fibroblast and keratinocyte cell lines even beneath identified concentrations. While photo-induced cleavage is a key event that leads to tattoo clearing during laser removal, it can also occur on a smaller scale when tattooed skin is exposed to natural light, particularly in the ultraviolet (UV) range. Since light-induced effects are the most common side effects associated with tattoos, our goal was to investigate the underlying pathomechanisms accordingly. However, no in vitro model that accurately resembles the architecture of tattooed human skin has been described in the literature so far. Therefore, we established a 3D in vitro ‘tattooed’ full thickness skin model (TatSFT) as an animal replacement model for tattoo research. The uptake of the tattoo pigments used in this study, titanium dioxide (TiO2) anatase, TiO2 rutile, Pigment Orange (P.O.)13 and carbon black by dermal fibroblasts was proven by electron microscopy in TatSFT. Despite this uptake, the pigments showed no effect on the viability of TatSFT nor its dermal compartment (TatSDE). Concordantly, cytokine secretion, general histology, and the expression of important skin homeostasis markers was unaffected by tattoo pigments in TatSFT. Contrary to the absence of toxicity in 3D, TiO2 anatase significantly decreased cell viability and increased interleukin-8 release in 2D monolayer cultured fibroblasts. Due to the inherent differences in toxicity sensitivity of 2D monolayered cultured fibroblasts and 3D cultured models, we investigated phototoxicity of tattoo pigments in both, 2D and 3D. Concordantly with particle toxicity, phototoxic effects were bigger in monolayer cultured fibroblasts than in 3D. While TiO2 showed strong phototoxic effects in 2D, these effects were absent in TatSFT. However, UVB induced DNA damage marker levels in the dermis of TatSFT were reduced by pigments. Combined with photoprotective effects found in TatSDE concerning viability, these data suggest photoprotective properties of tattoo pigments for the tattooed dermis and its underlying tissue. Contrary to these results, we found P.O.13 to alter cytokine secretion upon UV irradiation in both, 2D and TatSDE. While minor amounts of cleavage products of P.O.13 were identified after UV irradiation, we were unable to proof that these cleavage products might have resulted in adverse effects. The data in this thesis not only highlight the need for 3D test systems for tattoo phototoxicity research, but also present a highly modifiable 3D in vitro test system for this purpose. This work also strengthens concerns regarding TiO2 anatase and azo pigments like P.O.13 and their use in tattoo inks.

Mit dem Tätowieren erfreut sich heutzutage ein Verfahren größter Beliebtheit, bei dem Farbstoffe dauerhaft in die menschliche Haut eingebettet werden, um permanente Bilder in dieser zu erzeugen. Momentan ist jeder fünfte bis vierte Mensch tätowiert. Dieser Beliebtheit scheint die hohe Zahl an tätowierungsbedingten Nebenwirkungen keinen Abbruch zu tun. Viele Nebenwirkungen treten insbesondere dann auf, wenn die tätowierte Haut mit Licht in Berührung kommt. Insgesamt machen lichtinduzierte Nebenwirkungen etwa 60 % der tätowierungsassoziierten Nebenwirkungen aus. In dieser Arbeit wurden daher die Wechselwirkungen von ultraviolettem Licht und Laserlicht auf Tätowierpigmente und die daraus resultierenden Effekte auf menschliche Hautzellen untersucht, um das Verständnis für lichtinduzierte Nebenwirkungen in tätowierter Haut zu erhöhen. Zunächst behandelten wir postmortem tätowierte Schweinehaut mit Lasern, die zur Tattooentfernung verwendet werden. Anschließend analysierten wir die Spaltprodukte mittels gaschromatographischer Trennung gekoppelt mit massenspektrometrischer Detektion. 3,3'-Dichlorbenzidin, ein Karzinogen, welches durch die Spaltung von Pigment Orange (P.O.)13 entsteht, erwies sich in menschlichen Fibroblasten- und Keratinozyten-Zelllinien bereits unterhalb identifizierter Konzentrationen als zytotoxisch und genotoxisch in Form von DNA-Doppelstrangbrüchen. Während die photoinduzierte Spaltung ein Schlüsselereignis ist, das bei der Laserentfernung zum Verblassen der Tätowierungen führt, kann sie auch in kleinerem Umfang auftreten, wenn tätowierte Haut natürlichem Licht, insbesondere im ultravioletten (UV) Bereich, ausgesetzt wird. Da lichtinduzierte Effekte die häufigsten Nebenwirkungen im Zusammenhang mit Tätowierungen sind, war es unser Ziel, die zugrunde liegenden Pathomechanismen entsprechend zu untersuchen. Allerdings wurde in der Literatur bisher kein in vitro Modell beschrieben, das die Architektur tätowierter menschlicher Haut genau nachbildet. Daher etablierten wir ein 3D in vitro "tätowiertes" Vollhautmodell (TatSFT) als Tierersatzmodell für die Tätowiermittelforschung. Die Aufnahme der in dieser Studie verwendeten Tattoo-Pigmente Titandioxid (TiO2) Anatas, TiO2 Rutil, Pigment Orange (P.O.)13 und Carbon Black durch dermale Fibroblasten wurde elektronenmikroskopisch in TatSFT nachgewiesen. Trotz dieser Aufnahme zeigten die Pigmente keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von TatSFT oder dessen dermales Kompartiment (TatSDE). Auch die Zytokinsekretion, die allgemeine Histologie und die Expression wichtiger Marker der Hauthomöostase wurden durch die Tattoo-Pigmente in TatSFT nicht beeinflusst. Im Gegensatz zur fehlenden Toxizität in 3D verringerte TiO2-Anatas signifikant die Zellviabilität und erhöhte die Interleukin-8-Ausschüttung in 2D-monolayer kultivierten Fibroblasten. Aufgrund der inhärenten Unterschiede in der Toxizitätsempfindlichkeit von 2D-monolayer kultivierten Fibroblasten und 3D kultivierten Modellen, untersuchten wir die Phototoxizität von Tattoo-Pigmenten sowohl in 2D als auch in 3D. Übereinstimmend mit der Partikeltoxizität waren die phototoxischen Effekte in Einzelschicht-kultivierten Fibroblasten größer als in 3D. Während TiO2 starke phototoxische Effekte in 2D zeigte, waren diese Effekte in TatSFT nicht vorhanden. Allerdings wurden die UVB-induzierten DNA-Schadensmarker in der Dermis von TatSFT durch die Pigmente reduziert. In Kombination mit den photoprotektiven Effekten, die in TatSFT hinsichtlich der Lebensfähigkeit gefunden wurden, deuten diese Daten auf photoprotektive Eigenschaften von Tätowierpigmenten für die tätowierte Dermis und das darunter liegende Gewebe hin. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen fanden wir, dass P.O.13 die Zytokinsekretion bei UV-Bestrahlung sowohl in 2D als auch in TatSDE verändert. Obwohl geringe Mengen an Spaltprodukten von P.O.13 nach UV-Bestrahlung identifiziert wurden, konnten wir nicht nachweisen, dass diese Spaltprodukte nachteilige Effekte hervorgerufen haben könnten. Die Daten in dieser Arbeit unterstreichen nicht nur die Notwendigkeit von 3D-Testsystemen für die Forschung zur Phototoxizität von Tätowierungen, sondern stellen auch ein hochgradig modifizierbares 3D in vitro Testsystem für diesen Zweck dar. Zusätzlich stärkt diese Arbeit auch die Bedenken bezüglich der Verwendung von TiO2 Anatas und Azopigmenten, wie P.O.13, in Tätowiertinten.