The MYCN oncogene as a minimal residual disease marker and therapeutic target in neuroblastoma

Abstract

Neuroblastoma, the most common extracranial solid childhood cancer, arises from precursors of the developing sympathetic nervous system. MYCN oncogene amplification is a determinant of high risk and occurs in ~25% of neuroblastomas. Despite intensive treatment, more than half these patients succumb to their disease, implying persistence of therapy-resistant MYCN-amplified minimal residual neuroblastoma cells. This thesis proposes a comprehensive concept for the specific diagnostic detection of the MYCN amplicon and evaluates new treatment options for MYCN-amplified neuroblastoma. Disease-relevant nucleotide changes, structural gene rearrangements and copy number alterations were detected in tumor material by next-generation sequencing of a customized hybrid capture-based targeted panel. Unique MYCN amplicon breakpoints in the rearranged gene constitute a target sequence for a personalized minimal residual disease (MRD) PCR diagnostic. MYCN amplicon breakpoints in neuroblastoma cell lines and tumors were identified and recovered by individual, semi-quantitative PCR assays and Sanger sequencing. The assay was further developed for highly sensitive, real-time quantitative and droplet digital PCR detection for selected MYCN breakpoints in cell lines. MRD level detected in bone marrow aspirates collected during therapy outlined different disease courses in patients, including MRD persistence until relapse and good response to the first treatment course. Combining multi-agent chemotherapy in current high-risk protocols with indirect MYCN inhibitors provides a potential route to improve poor cure rates for MYCN-amplified neuroblastomas. Different hyperactive biological networks in MYCN-amplified neuroblastoma were tackled using small molecule inhibitors of the bromodomain and extra-terminal (BET) domain-containing protein BRD4, phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and polo-like kinase 1 (PLK1). BET (JQ1, OTX015 and TEN-010) and kinase (alpelisib, volasertib and rigosertib) inhibitors demonstrated anti-cancer activity by diminishing viability in cell line-based drug screens at nanomolar to low micromolar concentrations. Rigosertib treatment altered PLK1 and PI3K signaling and strongly impaired the cellular ability for wound healing and colony formation. In line with in vitro observations, rigosertib reduced tumor growth in patient-derived neuroblastoma xenografts in mice. Combining OTX015 and volasertib produced synergistic anti-tumor responses in two MYCN-amplified neuroblastoma cell lines. To prevent MYCN-driven proliferation of tumor cells, further indirect MYCN targets are also being considered. This is exemplified by a substrate of PLK1, ASPM, which is elevated in MYCN-amplified primary neuroblastomas. Knockdown of ASPM, a microtubule-associated protein involved in mitotic spindle assembly, in MYCN-amplified neuroblastoma cell lines reduced viability and proliferation, accompanying a neuronal differentiation phenotype with neurite-like outgrowth, cytoskeletal changes and increased expression of differentiation markers. This study presents clinical implementable molecular diagnostics to pinpoint unique MYCN-amplified neuroblastoma cells within non-invasively accessible biopsy material, and proposes indirect small molecule-based MYCN therapies and potentially new drug targets for a personalized treatment.

Das Neuroblastom, der häufigste extrakranielle solide Krebs im Kindesalter, entsteht aus Vorläuferzellen des sich entwickelnden sympathischen Nervensystems. Eine Amplifikation des MYCN-Onkogens ist ein bestimmender Faktor für ein hohes Risiko und tritt bei ~25% der Neuroblastome auf. Trotz intensiver Behandlung erliegt mehr als die Hälfte dieser Patienten ihrer Krankheit, was die Persistenz therapieresistenter, MYCN-amplifizierter minimaler Restneuroblastomzellen impliziert. Diese Arbeit stellt ein umfassendes Konzept für den spezifischen, diagnostischen Nachweis des MYCN-Amplikons vor und evaluiert neue Behandlungsoptionen für MYCN-amplifizierte Neuroblastome. Krankheitsrelevante Nukleotidveränderungen, strukturelle Genrearrangements und Kopienzahl-veränderungen wurden im Tumormaterial mit Hilfe eines maßgeschneiderten, zielgerichteten hybrid-capture-basierten Next Generation Sequencing (NGS) Assays nachgewiesen. Einzigartige MYCN-Amplikon-Bruchpunkte im rearrangierten Gen stellen eine Zielsequenz für eine personalisierte PCR-Diagnostik der minimalen Resterkrankung (MRD) dar. MYCN-Amplikon-Bruchpunkte in Neuroblastom-Zelllinien und Tumoren wurden durch individuelle, semi-quantitative PCR-Assays und Sanger Sequenzierung identifiziert und wiedererkannt. Der Assay wurde für den hochsensitiven, quantitativen Echtzeit- und digitalen Tröpfchen-PCR-Nachweis für ausgewählte MYCN-Bruchpunkte in Zelllinien weiterentwickelt. Die MRD Level, die in den während der Therapie gesammelten Knochenmarkaspiraten nachgewiesen wurden, skizzierten die verschiedenen Krankheitsverläufe bei den Patienten, einschließlich der MRD-Persistenz bis zum Rezidiv und des guten Ansprechens auf den ersten Behandlungsabschnitt. Die Kombination der Multi-Wirkstoff-Chemotherapie in den aktuellen Hochrisikoprotokollen mit indirekten MYCN-Inhibitoren stellt einen möglichen Weg dar, die schlechten Heilungsraten für MYCN-amplifizierte Neuroblastome zu verbessern. Verschiedene, hyperaktive biologische Netzwerke in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen wurden mit niedermolekularen Inhibitoren der Bromdomäne und des extra-terminalen (BET) domänenhaltigen Proteins BRD4, der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) und der polo-ähnlichen Kinase 1 (PLK1) behandelt. BET (JQ1, OTX015 und TEN-010) und Kinase-Inhibitoren (Alpelisib, Volasertib und Rigosertib) zeigten eine krebshemmende Wirkung, indem sie die Viabilität in zelllinienbasierten Wirkstoff-Screens bei nanomolaren bis niedrigen mikromolaren Konzentrationen verminderten. Die Behandlung mit Rigosertib veränderte die PLK1- und PI3K-Signalübertragung und beeinträchtigte die zelluläre Fähigkeit zur Wundheilung und Koloniebildung stark. In Übereinstimmung mit In-vitro-Beobachtungen reduzierte Rigosertib das Tumorwachstum in von Patienten stammenden Neuroblastom-Xenografts bei Mäusen. Die Kombination von OTX015 und Rigosertib erzeugte synergistische antitumorale Aktivität in zwei MYCN-amplifizierten Neuroblastom-Zelllinien. Um die MYCN-gesteuerte Proliferation von Tumorzellen zu verhindern, werden weitere indirekte MYCN-Targets in Betracht gezogen. Ein Beispiel hierfür ist ein Substrat von PLK1, ASPM, das in MYCN-amplifizierten, primären Neuroblastomen erhöht ist. Das Herunterregulieren von ASPM, einem Mikrotubuli-assoziierten Protein, das an der mitotischen Spindelanordnung beteiligt ist, führte in MYCN-amplifizierten Neuroblastom-Zelllinien zu einer verminderten Viabilität und Proliferation, was mit einem neuronalen Differenzierungsphänotyp mit neuritenartigem Auswuchs, zytoskelettalen Veränderungen und erhöhter Expression von Differenzierungsmarkern einherging. Diese Studie stellt eine klinisch umsetzbare, molekulare Diagnostik vor, um einzigartige MYCN-amplifizierte Neuroblastomzellen in nicht-invasiv zugänglichem Biopsiematerial zu detektieren, und schlägt indirekte, niedermolekular-basierende MYCN-Therapien und potenziell neue Zielmoleküle für eine personalisierte Krebsbehandlung vor.