Synpolydaktylie in Mensch und Maus: molekulargenetische Untersuchung von Polyalanin-Expansionen

Abstract

In dieser Studie wurde die rezessive Mausmutante synpolydactyly homolog" (spdh) als Modell für menschliche Synpolydaktylie (SPD) untersucht. Bei der Mutation handelt es sich um die Expansion eines Polyalanin-kodierenden Repeats in der 5`-Region von Hoxd13. Man findet bei Menschen mit SPD Expansionen von +7 bis +14 Alaninen. Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Länge der Expansion und der Penetranz und Schwere des Phänotyps. In der spdh-Maus ist der Repeat um +7 Alanine verlängert. Der Phänotyp besteht aus Syndaktylie, Polydaktylie und Brachydaktylie. Der Phänotyp der homozygoten spdh-Maus wurde in dieser Studie im Detail untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass 3 Entwicklungsprozesse gestört sind, die frühe Musterbildung in den Pfoten, die Ausbildung der Gelenke in den Metakarpalen und Phalangen und die Differenzierung des Knorpels zu Knochen. Zelltransfektionen mit Hoxd13-Konstrukten mit verschieden langen Repeats zeigten, dass die Expansionen zu einer Verlagerung des Proteins vom Zellkern ins Zytoplasma Bildung amorpher Aggregate führen. Die Frequenz der Aggregatbildung steigt dabei mit zunehmender Länge der Expansion an. In die Aggregate wurden Hitze Schock Proteine (HSP40 und 70) rekrutiert, die bei der Erkennung und Neu- Faltung fehlgefalteter Proteine eine Rolle spielen. Eine verstärkte Aktivierung dieser HSPs durch Geldanamycin führte zu einer reduzierten Bildung von Proteinaggregaten. Dies sind deutliche Hinweise darauf, dass diese Mutation in Hoxd13 zu einer Fehlfaltung des Proteins führt. Durch Immuncytochemie auf Schnitten und Western Blot Analysen konnte außerdem gezeigt werden, dass in vivo das mutierte Protein zum Großteil abgebaut wird, und dass das vorhandene mutierte Protein im Gegensatz zum Wt hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Anhand eines Luciferase-Assays mit einem Bmp4 -Promoter-Konstrukt, dessen Transkription durch Hoxd13 aktiviert wird, konnte außerdem gezeigt werden, dass die Aktivität des Proteins deutlich durch die Expansion des Alanin-Repeats reduziert wird. Durch die Mutation wird also nicht nur die Lokalisation, sondern auch die Funktion des Proteins beeinträchtigt. Um zu untersuchen, ob Polyalanin-Expansionen in Transkriptionsfaktoren generell zu Fehlfaltung und Aggregatbildung führen, wurden noch 3 andere Proteine, die Alanin-Repeats besitzen, in der Zellkultur untersucht. Für Hoxa13, Runx2 und Sox3 konnte in vitro ebenfalls gezeigt werden, dass die Expansionen des Repeats zu einer Verschiebung der Lokalisation ins Zytoplasma mit Aggregatbildung führen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Verlängerung eines Polyalanin-Repeats in einer Fehlfaltung des Proteins und, abhängig von der Effizienz des Abbaus, in Aggregatbildung resultiert.

In this study the recessive mouse mutant "synpolydactyly homolog" (spdh) was investigated as a model for human Synpolydactyly (SPD). The mutation consists of an expansion of the polyalaine-coding repeat in the 5`-region of Hoxd13. In humans showing SPD, expansions from +7 to +14 additional alanines are found. There exists a correlation between the length of expansion and the penetrance and severity of the phenotype. In the spdh-mouse, the alanine-coding repeat is expanded by +7 alanines. The phenotype consists of syndactyly, polydactyly and brachydactyly. The phenotype of the homozygous spdh-mouse was investigated in detail in this study. It could be shown, that 3 developmental processes are disrupted, the early patterning of the limb, the development of joints in the metacarpals and phalanges and the differentiation of the cartilage to bone. Cell-transfections using Hoxd13 constructs with different lengths of the repeat showed, that the expansions lead to a change in the localisation of the protein from nucleus to cytoplasm with formation of amorphous aggregates. The frequency of aggregate-formation increased with an increasing length ot the expansion. Heat-shock-proteins (HSP40 and 70), which are involved in the recognition and re-folding of misfolded proteins, were recruited into the aggregates. The increased activation of these HSPs using Geldanamycin resulted in a reduction of protein aggregate formation. These are clear hints, that the mutation in Hoxd13 leads to the misfolding of the protein. Immunocytochemistry on sections and western blot analysis revealed, that the majority of the mutated protein in vivo becomes degraded, but the remaining protein is localized predominantly in the cytoplasm in contrast to the wt. In a luciferase assay using a Bmp4-promoter-construct, whose transcription can be activated by Hoxd13, it could also be shown, that the activity of the protein is markedly reduced by the expansion of the alanine-repeat. Thus, the expansion not only affects the localisation but also the function of the protein. To investigate if polyalanine-expansions in transcription factors in general might result in misfolding and aggregate formation, 3 other proteins harbouring alanine-repeats were tested in the cell-culture system. It could also be shown in vitro for Hoxa13, Runx2 and Sox3 that the expansion of the repeat resulted in a displacement of the protein-localisation into the cytoplasm with aggregate formation. The results of this study indicate, that the expansion of a polyalanine repeat results in misfolding of the protein and, dependent on the efficiency of degradation, in aggregate formation.