Untersuchungen zur Kultivierung, genetischen Differenzierung und Pathogenese von Capillaria spp. beim Huhn

Abstract

Capillaria obsignata gehört mit Ascaridia galli und Heterakis gallinarum zu den häufigsten Nematodenarten des Haushuhns. Am Department für Nutztierwissenschaften der Georg-August-Universität Göttingen wurden bereits Forschungsarbeiten zur genetisch bedingten Parasitenresistenz insbesondere gegenüber den Spezies A. galli und H. gallinarum durchgeführt. Um weitere Forschungsprojekte auch bei der Gattung Capillaria etablieren zu können, sollten die Handhabung und das Verhalten von C. obsignata–Eiern hinsichtlich der Embryonierung nach Inkubation in verschiedenen Medien sowie die anschließende künstliche Infektion untersucht werden. Im ersten Versuch wurde die Entwicklungsphase der nicht embryonierten C. obsignata-Eier in vier Kulturmedien (0,5 % und 2 % Formalin, 0,1 % Kaliumdichromat und 0,1 N Schwefelsäure) in uteri miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten Eier (> 82 %) in den ersten zwei Dritteln des Uterus in intakten Weibchen das Potenzial zur Embryonierung haben, ohne dass dabei ein Einfluss des Inkubationsmediums zu beobachten war. Die anschließende Zerstörung der Weibchen mittels Potters Homogenisator zur Gewinnung einer Suspension führte jedoch zu einer signifikanten Reduktion embryonierter Eier (< 33 %). Die nachfolgende Verwendung im Rahmen einer experimentellen Infektion wurde mit vier verschiedenen Infektionsdosen (250, 500, 1000, 2000 Eier) und den, sich im Uterus der Weibchen befindlichen und jeweils in den o.g. vier Medien inkubierten, vollständig embryonierten Eiern durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass 0,5-prozentiges Formalin und Schwefelsäure mit Etablierungsraten, der nach Inkubation in diesen Medien gewonnenen Eier von 54 % respektive 43 % erfolgreich als Inkubationsmedien für C. obsignata-Eier verwendet werden können. Die Inkubation in Kaliumdichromat hingegen scheint die Infektiosität der Eier negativ zu beeinflussen und ging mit einer Etablierungsrate von lediglich 6,5 % einher (P<0,001). Eine Leistungsdepression des Wirtstieres bei Infektionsdosen von 250 bis 2000 Eiern wurde nicht beobachtet. Im Verlauf weiterer Untersuchungen sollten die vier häufigsten Capillaria-Arten des Geflügels (C. obsignata, C. bursata, C. caudinflata und C. anatis) zuerst morphologisch unterschieden werden. Anschließend erfolgte eine genetische Differenzierung basierend auf der Sequenzierung des Gens der ersten Untereinheit der Cytochrom C Oxidase (COI) der mitochondrialen DNA. Bei 41 C. obsignata-Individuen konnte ein COI-Fragment von 568 bp (C.o._1) erfolgreich sequenziert werden. Eine weitere Sequenz mit 433 bp wurde in sieben C. bursata, fünf C. anatis und zwei C. caudinflata gefunden (C. spp. _abc_3). Außerdem zeigten drei weitere C. bursata-Individuen eine eigene Sequenz mit 424 bp (C.b._2). Die Übereinstimmung der drei Sequenzen lag im Bereich von 81.4 bis 84.5 %. Das Ergebnis der Sequenz C. spp. _abc_3 ist als fraglich zu betrachten, da sich die drei Arten morphologisch generell zuverlässig von- einander unterscheiden lassen. Es muß in Betracht gezogen werden, dass die erhaltenen Sequenzdaten auf Amplifikation von bereits zuvor vervielfältigter DNA, d.h. in Folge von DNA-Kontamination, zurückzuführen sind. Weitere Untersuchungen, z.B. durch Sequenzierung weiterer Gene, sind erforderlich um dieser Frage nachzugehen.

Capillaria obsignata is, together with Ascaridia galli and Heterakis gallinarum, one of the most common nematode species in chicken. The Department of Animal Sciences, Georg-August-University Göttingen, researches on the genetic resistance against parasites in chicken. Especially studies concerning resistance in chicken against the species A. galli and H. gallinarum have been published before. In order to establish further research projects on Capillaria, the handling and behavior of C. obsignata during incubation and embryonation and the subsequent artificial infection has to be investigated. In the first experiment the in uteri development of non-embryonated C. obsignata eggs in four different incubation media (0.5 % and 2 % formalin, 0.1 % potassium and 0.1 N sulfuric acid) were compared. The results showed that most of the eggs (> 82 %) in the first two-thirds of uteri in the intact females have the potential for embryonation without being influenced by the incubation media. However, the subsequent disruption of the females by Potters homogenizer to obtain a suspension of the eggs, led to a significant loss of embryonated eggs (< 33 %). For the second experiment an infection of chickens with four different infection dosages (250, 500, 1000 and 2000 eggs) was performed. Prior to use for experimental infection the eggs were incubated in the uteri of the female worms to complete embryonation in the four different media. It emerged that 0.5 % formalin and sulfuric acid which produce eggs with establishment rates of 54 % and 43 %, respectively, can be successfully used as incubation media for C. obsignata eggs, whereas potassium dichromate which produces eggs resulting in an establishment rate of 6.5 %, impairs subsequent infectivity of the eggs (P<0.001). The effects of media on the infectivity of the eggs were confirmed to be fairly repeatable. Noteworthy, no harmful effect of infection was encountered concerning the host animal performance with the infection doses from 250 up to 2000 eggs. In the third experiment the four most prevalent Capillaria species in poultry (Capillaria obsignata, Capillaria bursata, Capillaria caudinflata and Capillaria anatis) were distinguished morphologically. This was followed by a genetic differentiation with the sequencing of the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene of the mitochondrial DNA. A COI fragment of 568 bp (C.o._1) was successfully sequenced for 41 C. obsignata individuals. Another sequence with 433 bp was found in seven C. bursata, five C. anatis, and two C. caudinflata (C.spp._abc_3). Furthermore three C. bursata showed a distinct sequence with 424 bp (C.b._2). Identities among the three different sequences ranged from 81.4 to 84.5 %. The results of the sequence C.spp._abc_3 are to be regarded as questionable, since the species can in general be reliably distinguished morphologically. It thus has to be considered, that the obtained sequences stems from the amplification of pre-amplified DNA i.e. as a consequence of contamination. Further investigations e.g. by sequencing additional genes are needed to clearify this issue.