Arteriogenesis in Gja5 (Connexin-40) deficient mice

Abstract

Cardiovascular diseases are the number one cause of death globally[104]. Arteries are the key vessels affected in cardiovascular diseases and the study of mechanisms of arterial growth and repair are, therefore, of fundamental interest. Arterial and venous vascular networks show a distinct genetic signature, function and branching architecture[105, 106]. Specification of arterial-venous vessel identity and formation of branched vascular networks occur during early embryogenesis and are modulated by hemodynamic factors[107-109], but the precise mechanisms are unclear. Blood circulation creates mechanical forces in vessels[28, 110] and affects oxygenation of developing organs. At present neuropilin-1[111, 112], Unc5b[116], Notch1, Notch4, Jag1, Jag2 and Dll4 [117-121], are established arterial markers. In the mouse, hemodynamic factors contribute to arterial-venous differentiation, involving regulation of arterial marker expression[108, 109]. In the adult, hemodynamic factors regulate the enlargement and outgrowth of collateral arterial networks upon arterial stenosis[3, 11]. Several molecules originally described in embryonic arterial remodeling, also modulate the efficiency of arterial collateralization in the adult[12]. Besides these classical morphogenes, arteries also express the gap-junctional proteins Gja4 (Connexin-37) and Gja5 (Connexin-40)[69, 122-124]. Gap junctional proteins mediate direct diffusion of signals between adjacent cells[125]. In the microcirculation, gap junction proteins facilitate electrical coupling between endothelial cells[41], which plays an important role in the regulation of vascular tone[59, 78], particularly in response to changes in tissue metabolic demand. The mechanism underlying arterial specific regulation of connexins is yet unknown. Objectives We hypothesized that arterial Gja5 expression plays a functional role in flow driven arteriogenesis. Methods In mice, Gja5 (Connexin-40) was expressed in arteries. Although the participation of the gap junction in vascular function seems to be very complex, the development of connexin-knockout animals has been a great contribution to our understanding of how these proteins work in the vasculature. We made use of different kinds of mice for Connexin-40 mutant (Gja5-/-), Connexin-40 floxed (Gja5f/f), and tamoxifen inducible Tie-2 Cre (Tie2CreERT2). Gja5 expressed in arterial endothelium mediates vasodilatory responses. To study the involvement of this functional component, we examined mice in which we deleted Gja5 expression specifically from the endothelium before FAO. We also set up flow driven arteriogenesis model: the hindlimb femoral artery occlusion model. In mice, ligation of the femoral artery results in the flow driven formation of a collateral arterial network that bypasses the occlusion. This process results in restoration of perfusion to the ischemic regions. The efficacy of this process can be assessed with repetitive non-invasive evaluation of hindlimb perfusion using laser-doppler flow imaging (LDF). The efficacy of blood transport into the compromised hindlimb depends on the size and number of the collateral arteries. To address this, we perfused the hindlimbs of Gja5-/- mutant and Gja5+/+ mice with contrast agent (Microfil) under maximal vasodilatory conditions, and imaged the morphology of the collateral arterial network at 7 days after FAO using MicroCT. To image vessels below the detection limit of the MicroCT, we used histological analysis of the upper calf muscle. Results We observed significantly smaller lumen diameters in Gja5-/- mice when compared to Gja5+/+ mice. We also obtained genetic evidence in mice showing the functional importance of Gja5 in flow driven arterial remodeling and collateral arterial network development. Conclusion Our data support a model in which impaired flow-induced outward remodeling reduced the number of collaterals and there was no relationship between vasodilation mediated by loss of Gja5 and the perfusion deficit in Gja5-/- mutant mice.Genetic deletion of Gja5 function in mice resulted in reduced arteriogenesis in femoral artery occlusion models. Gja5 plays a functional role in flow driven arteriogenesis.

Herz-Kreislauf Erkrankungen sind die häufigste Todesursache weltweit. Hauptsächlich sind Arterien bei Herz-Kreislauf Erkrankungen betroffen, deren Untersuchung daher von grundlegendem Interesse ist. Arterielle und venöse Netzwerke weisen eine unterschiedliche genetische Signatur, Funktion und Verzweigungsmuster auf. Diese Spezifikation der arterio-venösen Gefäßidentität und die Bildung der verzweigten Gefäßnetzwerke treten während der Embryogenese auf und werden durch hämodynamische Faktoren moduliert. Die genauen Mechanismen sind bisher aber ungeklärt. Durch die Zirkulation des Blutes werden mechanische Kräfte auf die Gefäße ausgeübt, welche die Sauerstoffversorgung der entwickelnden Organe beeinflussen. In der Maus tragen hämodynamische Faktoren zur arteriellen-venösen Differenzierung bei, wie z.B. die Regulierung der Expression von arteriellen Markern. Derzeit sind Neuropilin-1, Unc5b, Notch1, Notch4, Jag1, Jag2 und Dll4 als arterielle Marker etabliert. In der adulten Maus wirken sich hämodynamische Faktoren auf die Vergrößerung des kollateralen arteriellen Netzwerkes nach arterieller Stenose aus. Bisher wurden einige Moleküle, die ursprünglich für den embryonalen arteriellen Umbau beschrieben worden sind, auch für die Modellierung der arteriellen Kollateralbildung im adulten Tier entdeckt. Neben den klassischen Morphogenen exprimieren Arterien die Gap-Junction Proteine Gja4 (Connexin-37) und Gja5 (Connexin-40). Gap Junction Proteine sind kanalbildende Proteinkomplexe, welche den Transport von Molekülen zwischen benachbarten Zellen direkt vermitteln. In der Mikrozirkulation ermöglichen Gap Junction Proteine die elektrische Kommunikation zwischen Endothelialzellen, die für den vaskulären Tonus eine wichtige Rolle spielen. Der zugrunde liegende Mechanismus der arteriellen Regulierung der Connexine ist aber noch unbekannt. Ziel Es wird vermutet, dass die arterielle Expression von Gja5 eine funktionale Rolle in der flow-driven Arteriogenese spielt. Methoden Mit Hilfe der Entwicklung der Connexin knockout (KO) Mäuse wurde ein großer Beitrag zum Verständnis der Gefäßfunktion der Gap Junction Proteine geleistet. Wir nutzten verschiedene Connexin KO Modelle: Connexin-40 (Gja5-/-), Connexin-40 floxed (Gja5f/f) und Tamoxifen induzierbare Tie-2 Cre Maus (Tie2CreERT2). Das im arteriellen Endothelium lokalisierte Gap Junction Protein Gja5 vermittelt vasodilatorische Signale. Zur Untersuchung von Gja5 entwickelten wir ein Modell für flow driven Arteriogenese: hindlimb femoral artery Okklusion (FAO). Um die Funktion von Gja5 näher zu analysieren, verwendeten wir Mäuse in denen die Expression von Gja5 spezifisch im Endothelium vor der FAO deletiert wurde. Die Okklusion der femoralen Arterie resultiert in der Bildung eines kollateralen arteriellen Netzwerkes, welches die Okklusion umgeht. Dieser Prozess führt zur Perfusion der ischämischen Region, dessen Effizienz mit einem Laser-Doppler-Fluß-Bildanalysator (LDF) bewertet werden kann. Die Effizienz des Bluttransports im Hinterlauf hängt von der Größe und Anzahl der Kollateralarterien ab. Unter vasodilatorischen Bedingungen perfundierten wir die Hinterläufe von Gja5-/- und Gja5+/+ Mäusen mit einem Kontrastmittel (Microfil) und bildeten die Morphologie der kollateralen arteriellen Netzwerke 7 Tage nach der FAO mit einem MicroCT ab. Die Kollateralen, welche nicht mit dem MircoCT erfasst werden konnten, wurden mit Hilfe histologischer Analysen bewertet. Ergebnisse Der Lumendurchmesser in den Gja5-/- Mäusen ist im Vergleich zu den Gja5+/+ Mäusen signifikant kleiner. Weiterhin konnten wir die funktionale Bedeutung von Gja5 in der flow driven Arteriogenese und der Entwicklung des kollateralen Netzwerkes auf genetischer Ebene zeigen. Fazit Die ermittelten Daten unterstützen ein Modell, indem durch Blutfluss induziertes beeinträchtigtes outward remodeling zu einer reduzierten Anzahl von Kollateralen führt. Genetische Deletion der Funktion von Gja5 in Mäusen führt zu verminderter Arteriogenese im FAO Modell. Gja5 übt eine funktionale Rolle in der flow driven Arteriogenese aus.