Die simultane Detektion von vier Neuroblastom-DNA-Targets in zellfreier DNA mittels droplet digital PCR

Abstract

Mit der Analyse von Liquid Biopsies kann das Neuroblastom, die häufigste extrakranielle soli-de Malignität der frühen Kindheit, in seiner inter- und intratumoralen Heterogenität dargestellt werden. Besonders die Detektion von MYCN- und ALK-Amplifikationen sowie von ALK-Mutationen, sind für die Therapieentscheidung essenziell, da diese mit einem schlechten Out-come einhergehen und ALK außerdem ein therapeutisches Target darstellt. Aufgrund der gerin-gen Volumina von Blutproben bei Kleinkindern und der generell geringen Konzentration an zellfreier DNA (cfDNA) im Blutplasma bedarf es hochsensitiver Analyseverfahren wie der droplet digital PCR (ddPCR). Durch Anpassung der Sonden- und Primerkonzentrationen für eine optimale Trennung der positiven und negativen Droplet-Fraktionen im ddPCR-Ansatz konnten zwei neue Quadruplex-ddPCR-Protokolle etabliert werden. Das erste Protokoll detek-tiert die Kopienanzahl der Zielgene MYCN und ALK simultan mit den zwei Referenzgenen NAGK und AFF3, um so eine mögliche Veränderung der Kopienanzahl der Zielgene zu berech-nen. Mit dem zweiten Protokoll werden die Hotspot-Mutationen ALKF1174L (Exon 23, Position 3522, C>A) und ALKR1275Q (Exon 25, Position 3824, G>A) gemeinsam mit ihren Wildtypen ALK1174 und ALK1275 detektiert und deren mutant allele fractions (MAF) bestimmt. Beide Quadruplex-Protokolle messen dieselben Kopienanzahlen von MYCN und ALK beziehungswei-se MAFs der beiden ALK-Mutationen in cfDNA von zehn verschiedenen Zelllinien wie bereits etablierte Duplex-Protokolle. Für die Analyse der Kopienanzahl und der MAFs wurden jeweils cfDNA und genomische DNA (gDNA) aus Plasma- und Tumorproben von insgesamt neun Pati-enten mit einem Neuroblastom mit den Quadruplex-Protokollen vermessen. Hierbei zeigt sich eine Übereinstimmung mit den Messungen im Duplex-Protokoll sowie eine Bestätigung der Ergebnisse durch Sequenzierung der Proben mittels whole exome sequencing (WES). Die neuen Quadruplex-ddPCR Protokolle reduzieren somit die benötigte Menge an limitiert verfügbaren Patientenproben auf ein Minimum und beschleunigen zudem die Analyse.

The analysis of liquid biopsies enables the presentation of the inter- and intratumoral heterogeneity of neuroblastoma, the most common extracranial solid malignancy in early childhood. Especially the detection of MYCN and ALK amplifications as well as ALK mutations, which are associated with a poor clinical outcome and ALK´s function as a therapeutic target, is essential for choosing the proper treatment. Due to small blood sample volumes in infants and the low concentration of cell-free DNA (cfDNA) in blood plasma in general, highly sensitive analytical methods as the droplet digital PCR (ddPCR) are necessary. By adjusting probe and primer concentrations for an optimal distinction between positive and negative droplet clusters in the ddPCR assay it was possible to establish two new quadruplex ddPCR assay protocols. The first protocol detects the copy numbers of the target genes MYCN and ALK simultaneously with the two reference genes NAGK and AFF3 to calculate potential copy number variations in the target genes. The second protocol detects the hotspot mutations ALKF1174L (exon 23, position 3522, C>A) and ALKR1275Q (exon 25, position 3824, G>A) in combination with their wildtypes ALK1174 and ALK1275 and determines their mutant allele fractions (MAF). Both quadruplex ddPCR protocols measure the same MYCN and ALK copy numbers or rather the mutant allele fractions of the two ALK mutations in cfDNA from ten different cell lines as already established duplex ddPCR protocols. For the analysis of the copy numbers and MAFs, cfDNA and genomic DNA (gDNA) of plasma and tumor samples from nine patients with neuroblastoma were measured with the quadruplex protocols. The results showed an accordance with the measurements from the duplex ddPCR protocols and were confirmed by whole exome sequencing (WES) of each analysed sample. The new quadruplex ddPCR protocols reduce the required amount of limited available patient samples to a minimum and further accelerate the analysis.