Cold transduction mechanisms during peripheral neuropathic pain

Abstract

My Ph.D. thesis focuses on a common symptom of neuropathic pain: cold allodynia. Patients suffering from cold allodynia feel pain after stimuli which normally give a pleasant cool sensation. Despite the significant incidence and the important impact of this symptom, the molecular and physiological mechanisms underling alterations in cold sensitivity are still unknown. Recently, much progress has been made in our understanding of cutaneous thermal sensitivity, and different ion channels have been proposed as candidate of thermotrasduction in the sensory neurons. Above all two non- selective cation channels TRPM8 and TRPA1 have attracted much attention as potential sensors of cold. The goal of my Ph.D. project was to investigate whether changes in the mechanisms of temperature transduction might underlie cold hypersensitivity in a mouse model of neuropathic pain (the CCI model). To accomplish my task I used three different approaches. In the first approach I examined the functional traits of TRPM8, the main candidate of cold transducer, after nerve injury in vivo. The idea for this analysis is based on the findings that TRPM8 is activated by two different stimuli, cold and menthol. (Mc Kemy et al., 2002; Peier et al., 2002). Therefore we reasoned that if changes in TRPM8 underlie alteration of cold sensitivity after nerve injury, the same changes should occur in menthol sensitivity too. To check this hypothesis I first established a new behavioural assay to test the menthol sensitivity in mice, and indeed I observed that menthol evokes strong nociceptive behaviour after nerve injury. I then aligned the results of the menthol assay with the measurements of cold sensitivity. The increase in menthol sensitivity developed with the same time course of the emergence of cold allodynia, this suggests that activation of TRPM8 in CCI mice triggers nociceptive behaviour and that TRPM8 might be a key component of cold hypersensitivity. The second approach explored the expression of TRPM8 and TRPA1 in the dorsal root ganglia after nerve injury. For this analysis I performed two different techniques. I first quantified the mRNA levels of the TRP channels using qRT-PCR, and I then used a combination of in situ hybridization and immunohistochemstry to identify the neuronal populations expressing the TRP channels. Surprisingly, after nerve injury I observed decrease in the expression of TRPM8 as well as of TRPA1 in both the mRNA levels and the percentage of expressing neurons. The last approach involved an in vitrofunctional analysis of sensory neurons. My goal was to investigate the cold sensitivity and the function of the TRPM8 and TRPA1 after nerve injury. I carried out calcium imaging experiments in acutely dissociated DRG neurons to analyse the populations of neurons sensitive to cold, menthol (the TRPM8 agonist) and mustard oil (the TRPA1 agonist). The major findings of these experiments are: There is no relation between cold sensitivity and TRPA1 expression (only 18% of TRPA1 expressing neurons are cold sensitive). This confirms our previous work, where we reported that TRPA1 is not a cold sensor (appendix 2). The percentage of mustard oil sensitive neurons decreases after nerve injury, which agrees with my expression analysis for TRPA1. After nerve injury no difference appears in the percentage as well as in the properties of the cold sensitive neurons, and this is valid for both the menthol sensitive and menthol insensitive populations of cold sensitive neurons. In conclusion my results did not confirm our initial hypothesis and cold allodynia in this mouse-model does not result from an increase in the expression and function of the cold sensitive TRP channels. Nevertheless TRPM8 seems to have a role in the emergence of cold allodynia, and we suggest that this role might be explained by changes in the spinal connections of the TRPM8 expressing neurons. As yet this hypothesis has not been proven.

Meine Doktorarbeit beschäftigt sich mit einem bekannten und verbreiteten Symptom neuropathischer Schmerzen: der Kälteallodynie. Patienten, die unter Kälteallodynie leiden, empfinden einen normalerweise angenehm kühlen Stimulus als schmerzhaft. Trotz des häufigen Auftretens und der bedeutenden Belastung dieses Symptoms, sind die den Änderungen in der Kälte-Sensitivität zugrundeliegenden molekularen und physiologischen Mechanismen bisher unbekannt. In letzter Zeit wurden wichtige Fortschritte zum Verständnis der thermalen Sensitivität der Haut gemacht und in diesem Zusammenhang verschiedene Ionenkanäle als mögliche Kandidaten für thermische Transduktion in sensorischen Neuronen vorgeschlagen. Besondere Aufmerksamkeit erlangten zwei nicht-selektive Ionenkanäle- TRPM8 und TRPA1- als mögliche Kälte- Sensoren. Ziel meiner Doktorarbeit war es, zu untersuchen, ob eine Veränderung im Mechanismus der thermischen Transduktion verantwortlich für Kälte- Hypersensitivität in einem neuropathischen Schmerzmodell (CCI-Model) in der Maus ist. Hierfür nutzte ich drei verschiedene Ansätze. Im ersten Ansatz untersuchte ich die funktionellen Eigenschaften von TRPM8, dem wahrscheinlichsten Kälte-Sensor Kandidaten, nach einer Verletzung eines Nervens in vivo Die Idee für diese Analyse basiert auf dem Befund, dass TRPM8 durch zwei Stimuli aktiviert werden kann, Kälte und Menthol McKemy et al., 2002; Peier et al., 2002). Falls Änderungen in der TRPM8 Expression Abweichungen in der Kälte-Sensitivität hervorrufen sollten, erwarteten wir, dass diese Abweichungen auch in der Menthol-Sensitivität auftreten. Um diese Hypothese zu überprüfen, etablierte ich einen neuen Verhaltenstest für Menthol-Sensitivität in Mäusen und konnte in der Tat beobachten, dass Menthol nach Verletzung eines Nervens ein starkes Schmerzverhalten hervorruft. Anschließend verglich ich die Ergebnisse des Mentholtests mit den Messungen der Kälte-Sensitivität. Der Anstieg in der Menthol-Sensitivität trat gleichzeitig mit der Entstehung der Kälteallodynie auf, was darauf hinweist, das die Aktivierung von TRPM8 in den CCI Mäusen das Schmerzverhalten zu beeinflussen scheint und TRPM8 eine Schlüsselkomponente der Kälte- Hypersensitivität sein könnte. Der zweite Ansatz untersuchte die Expression von TRPM8 und TRPA1 in den dorsalen Hinterwurzelganglien nach Verletzung des Nerven. Für diese Analyse nutzte ich zwei unterschiedliche Techniken. Zuerst quantifizierte ich die mRNA-Levels von TRP-Kanälen mittels qRT-PCRund benutzte anschließend eine Kombination aus in situ Hybridization und Immunhistochemie, um die TRP-Kanal exprimierende Neuronenpopulation zu identifizieren. Überraschenderweise beobachtete ich nach Verletzung des Nervens eine Abnahme von TRPM8 und TRPA1, sowohl in den mRNA-Levels als auch in der Prozentzahl der exprimierenden Neurone. Der letzte Ansatz beinhaltete eine funktionelle in vitro Analyse der sensorischen Neurone. Mein Ziel war es, die Kälte- Sensitivität und die Funktion von TRPM8 und TRPA1 nach Verletzung des Nervens zu untersuchen. Ich führte “ calcium imaging” Experimente in entnommenen DRG Neuronen durch, um die Neuronenpopulation zu analysieren, die sensitiv auf Kälte, Menthol (TRPM8 Agonist) und Senföl (TRPA1 Agonist reagiert. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Experimente sind: Es gibt keine Beziehung zwischen Kälte-Sensitivität und TRPA1 Expression (nur 18% der TRPA1 exprimierenden Neurone sind kältesensitiv). Das bestätigt frühere Arbeiten, in denen wir zeigten, dass TRPA1 kein Kälte-Sensor ist (Appendix 2). Die Prozentzahl Senföl-sensitiver Neurone nahm nach Verletzung des Nervens ab, dies stimmt mit meiner Expressionsanalyse für TRPA1 überein. Nach Verletzung des Nervens trat kein Unterschied in der Prozentzahl sowie den Eigenschaften von kältesensitiven Neuronen auf, dies gilt für mentholsensitive und nicht- mentholsensitive Populationen kältesensitiver Neurone. Zusammenfassend bestätigen unsere Ergebnisse unsere ursprüngliche Hypothese nicht. Die Kälteallodynie im genannten Mausmodel resultiert nicht aus einem Anstieg in der Expression und Funktion der kältesensitiven TRP-Kanäle. Nichtsdestotrotz scheint TRPM8 eine Rolle in der Entstehung der Kälteallodynie zu spielen, und wir glauben, diese Rolle könnte anhand von Veränderungen in den spinalen Verbindungen TRPM8-exprimierender Neurone erklärt werden. Diese Hypothese ist bisher nicht untersucht.