Mukosale Zytokin-mRNA-Expression bei HIV-Patienten im Verlauf einer hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART)

Abstract

Die intestinale Mukosa ist für die Pathogenese der HIV-Infektion von besonderer Bedeutung. Hier findet eine hohe HIV-Replikation und ein schneller CD4+T-Zellverlust statt. Die Ursachen hierfür sind bisher unbekannt. Lokale Zytokine könnnen hierbei eine besondere Rolle spielen. Ziele dieser Arbeit waren daher a) die Bestimmung der Expression mukosaler Zytokine, die für die HIV-Replikation von Bedeutung sind und b) die Erfassung von Veränderungen der Zytokinexpression unter HAART. Hierfür wurde eine Methode entwickelt, die es erlaubt, aus geringen Mengen bioptischen Untersuchungsmaterials Zytokin- Expressionsmuster zu analysieren. Mittels Echtzeit-RT-PCR wurde in Sigmabiopsien von 7 Kontrollpersonen und zehn HIV- infizierten Patienten vor, sowie einen, vier und neun Monate nach Einleitung einer HAART die Zytokin- mRNA-Expression von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-16, IFN-γ, TNF-α, CCL3 und CCL5 basierend auf der LightCycler-Technik mit spezifischen Hybridisierungs- Detektionssonden gemessen und zur mRNA-Expression des Housekeeping-Gens GAPDH in Beziehung gesetzt. Im Vergleich zu Kontrollpersonen zeigten HAART-naive Patienten eine erhöhte mukosale mRNA-Expression für IL-4, IL-6, IL-10, IFN-?, TNF-?, CCL3 und CCL5, keine Unterschiede ergaben sich für IL-2 und IL-16. Diese Befunde zeigen eine erhöhte Aktivierung im mukosalen Immunsystem bei der HIV-Infektion, die allerdings keinem etablierten Th1- bzw. Th2-Muster entspricht. Nach Einleitung einer HAART kam es bei allen untersuchten Patienten zu einem schnellen Anstieg der mukosalen CD4+T-Zellzahl und einem deutlichen Abfall der mukosalen Viruslast unter die Nachweisgrenze, dennoch zeigte sich für HIV-infizierte Patienten im Vergleich zu Kontrollen weiterhin eine erhöhte mukosale mRNA- Expression für IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α, CCL3 und CCL5. Diese trotz effektiver Inhibition der Virusvermehrung gesteigerte Aktivierung des mukosalen Immunsystems spricht gegen eine entscheidende ursächliche Rolle der Virusreplikation oder viraler Antigene für die mukosale Immunaktivierung. Die hohe Virusreplikation in der intestinalen Mukosa bei unbehandelten Patienten ist daher eher Folge der gesteigerten Immunaktivierung, ein Effekt, der gerade für die hoch exprimierten inflammatorischen Zytokine TNF-α, IFN-γ und IL-6 plausibel erscheint. Die hohe Expression von CCL3 und CCL5 in Verbindung mit einer hohen HIV-Produktion bei unbehandelten Patienten deutet darauf hin, dass mögliche HIV- supprimierende Effekte dieser Zytokine durch die Rekrutierung und Aktivierung potentieller Zielzellen in der Mukosa aufgehoben werden. Ihre anhaltend hohe Expression unter HAART könnte weiterhin die schnelle und überschießende Repopulation des Dickdarms mit CD4+T- Zellen verursachen. HIV-infzierte T-Zellen und Makrophagen sezernieren inflammatorische Zytokine, die die epitheliale Barriere schädigen können. Auch nach Elimination des auslösenden Antigens durch HAART könnte eine solche durch HIV induzierte Barrierestörung über vermehrten Einstrom luminaler Antigene eine mukosale Entzündung aufrechterhalten. Ob und zu welchem Zeitpunkt sich die beschriebene Immunaktivierung unter effektiver Virussuppression zurückbildet, ist derzeit unklar. Zumindest neun Monate nach effektiver HAART finden sich in der intestinalen Mukosa eine im Vergleich zu Kontrollen sehr hohe Anzahl von CD4+T-Zellen und eine hohe Expression inflammatorischer Zytokine, die unter anderem auch die Expression der HIV-Korezeptoren CCR5 und CXCR4 stimulieren. Es liegen damit zahlreiche Zielzellen unter für die HIV-Infektion und -Replikation optimalen Bedingungen vor, die bei Therapieversagen oder Therapiepausen Ausgangspunkt für einen schnellen und ausgeprägten Rebound des HIV sein können.

Background: Diarrhoea and other gastrointestinal disorders are some of the most common manifestations of HIV-infection and AIDS. The mucosa-associated immune system (MALT) pertaining to the gastrointestinal tract probably houses the largest accumulation of immunocompetent cells in the body. Previous research has shown that the loss of CD4+T- cells during HIV-infection is much more pronounced in the mucosa than in the peripheral blood. This may be a consequence of the high level of viral replication seen in the mucosa. The reasons for these findings have been unclear. It has been suggested that the presence of HIV antigen may trigger the production of proinflammatory cytokines, which results in CD4+T-cell activation making these cells prone to HIV infection. In this scenario HIV enhances its own replication by stimulating cytokine production. Objectives: 1.) to quantitate the mRNA expression of selected proinflammatory, regulatory and HIV-inhibitory cytokines in the mucosa of HIV-infected patients and to compare it to healthy controls. 2.) to study the changes in cytokine expression in the course of highly active antiretroviral therapy (HAART). Methods: HIV-infected patients underwent endoscopic biopsy of colonic mucosa before and one, four and nine months after the start of HAART. Healthy volunteers, who underwent a single endoscopic biopsy served as controls. HIV-RNA and CD4+T-cell counts were measured in the blood and in the biopsy specimens. Quantitative real time PCR assays were developed to determine the mRNA expression of TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-2, IL-4, IL-10, IL- 16, CCL3 and CCL5 in the biopsy specimens. Specific hybridisation probes were used for the detection of the amplification products. Cytokine mRNA levels were normalised to mRNA levels of the housekeeping gene GAPDH. Results: The sensitivity of the RT-PCR assay for each cytokine and GAPDH was high with a limit of quantification of ten template copies/capillary. The calibration curve was linear over 5 orders of magnitude with R2 values > 0,998. For each of the cytokine PCRs the mean efficiency as expressed by the slope of the standard calibration curve was < 3,7 showing very little inter-assay variability (C.V. 2% - 14%). The intra-assay precision was satisfactory with C.V. < 10% throughout the whole calibration range. Nine HIV-1 infected males and one female were included in the study. The median (range) age was 42 (27 53). The median (range) plasma HIV RNA and CD4 cell count at baseline was 4,9 log-10 copies/ml (3,2 6,3) and 210 cells/µl (23 1217) respectively. The control group consisted of four males and three females with a median (range) age of 56 (48 70). The expression of the proinflammatory cytokines in the colonic mucosa was significantly higher in the HIV-infected patients as compared to the healthy controls: median (IQR) [copies cytokine mRNA/1000 copies GAPDH mRNA]; TNF-?: 1,67 (0,35 3,21) vs. 0,08 (0,06 0,11) p<0,05; IFN-?: 0,11 (0,09 0,72) vs. 0,02 (0,01 0,02) p<0,05; IL-6: 0,24 (0,14 0,95) vs. 0,01 (0,00 0,01) p<0,05. The expression level of the regulatory cytokines IL-4 and IL-10 was also higher in the HIV- infected study population: IL-4: 0,06 (0,03 0,41) vs. 0,01 (0,01 0,02), p<0,05; IL-10: 0,35 (0,11 0,84) vs. 0,01 (0,01 0,02) p<0,05. Accordingly the chemokines CCL3 and CCL5 were elevated in the HIV-infected study population: CCL3: 1,02 (0,69 3,81) vs. 0,11 (0,10 0,35) p<0,05; CCL5: 25,68 (15,24 132,10) vs. 8,80 (6,40 10,72); p<0,05. Despite a dramatic decline of virus load in both the blood and the mucosa and a rise of CD4+T-cells in the blood and the mucosa the high level of expression of all studied cytokines remained unchanged throughout nine months of HAART. Discussion: With the elimination of the HIV antigen from the mucosa we expected the expression of proinflammatory cytokines to fall. As cytokine production remained high despite fully suppressive antiviral therapy factors other than HIV must be responsible for causing mucosal inflammation. We suggest that the barrier of the colonic mucosa may have been disrupted earlier in the course of the infection leading to a continuous influx of luminal antigen, which maintains the inflammatory response even in the absence of the offending agent. The rapid repopulation of the mucosa with CD4+T-cells shown in this study could be explained by the chemotactic properties of CCL3 and CCL5 whose expression has been shown to be more than ten fold that of controls. Both the presence of a large number of CD4+T-cells and the continued high levels of inflammatory cytokines leading to T-cell activation could be the basis for the explosive virus replication often seen in the case of treatment interruption or failure.