Schädigung der weißen Substanz des unreifen Kleinhirns durch neonatale Hyperoxie und deren Vermeidung durch Minozyklin

Abstract

Neue Studien zeigen, dass neurologische Schädigungen nach Frühgeburt neben dem Großhirn oft auch das Kleinhirn betreffen. Das Kleinhirn sehr unreifer Frühgeborener ist in der Phase des stärksten Wachstums besonders vulnerabel. Als Zeichen der Schädigung findet sich häufig eine verminderte Volumenzunahme des Kleinhirns. Die zugrundeliegenden Ursachen sind bislang wenig verstanden. Neben Hypoxie-Ischämie, Infektion und Inflammation wird Hyperoxie diskutiert. Ziel unserer Studie war es, den Einfluss von Hyperoxie auf die Entwicklung der Weißen Substanz des Kleinhirns im Rattenmodell zu analysieren. Eine mögliche Protektion der Weißen Substanz untersuchten wir durch Gabe von Minozyklin. Sechs Tag alte Wistar-Ratten (P6) wurden für 24h bis P7 unter 80% O2 gehalten, gefolgt von einer Erholungsphase an Raumluft. Minozyklin Injektionen erfolgten zu Beginn und nach 12h Sauerstoffexposition. Mittels Nitrotyrosin Western-Blot konnte erhöhter oxidativer Stress nach Hyperoxie in P7 Kleinhirnen nachgewiesen werden. Immunhistochemische Färbungen zeigen in Kleinhirnen nach Hyperoxiebehandlung neben einer Reduktion proliferativer, Ki67+NG2+ OVZ eine Erhöhung apoptotischer, (TUNEL+) OVZ. Die Verringerung reifer, CC1+ Oligodendrozyten bestätigte eine Reifungsverzögerung nach Hyperoxie. Langzeitfolgen der Sauerstofftoxizität zeigten sich im MRT in einer signifikanten Volumenabnahme des Kleinhirns juveniler P30 und P60 Ratten nach Hyperoxie. Die für die Myelinisierung essentielle MBP-Expression war nach Hyperoxie bis P30 verringert. Im EM zeigte sich eine Hyperoxie-bedingte Hypomyelinisierung des Kleinhirns. In den Iba1 Färbungen zeigte sich kein Hinweis auf eine Mikroglia Aktivierung nach Hyperoxie. Eine Hyperoxie- induzierte Verminderung der astrozytären PDGF-A Sekretion im Kleinhirn in vivo und primären Astrozytenkulturen in vitro bestätigte eine mögliche gestörte Glia-Glia Interaktion. Der Einsatz von Minozyklin während der erhöhten Sauerstoffexposition ergab eine signifikant verbesserte Kleinhirnentwicklung. Neben einer Verringerung des oxidativen Stresses und verminderten Apoptoseraten der OVZ, konnte auch eine verbesserte Proliferation der OVZ beobachtet werden. Minozyklin verbesserte die oligodendrogliäre Reifung und die Volumenzunahme des Kleinhirns, unterband die Reduktion der MBP-Expression zu allen Zeitpunkten und verhinderte die Hypomyelinisierung nach Hyperoxie. Die Hyperoxie induzierte Reduktion der PDGF-A-Expression konnte mittels Minozyklingabe im Kleinhirn und auch in primären Astrozyten unterbunden werden. Zusammenfassend zeigt sich, dass das unreife Kleinhirn eine ausgeprägte Vulnerabilität gegenüber hohen Sauerstoff-Konzentrationen aufweist, die sowohl in einer akuten Schädigung von Oligodendroglia als auch in Langzeitfolgen für die weiße Substanz zu finden sind. Der erfolgreiche experimentelle Einsatz von Minozyklin deutet auf Möglichkeiten der pharmakologischen Prävention mittels anti-oxidativer Substanzen.

Due to resend insides, brain injury after preterm birth often includes reduced cerebellar volume. During a phase of exponential growth, the neonatal cerebellum shows a high vulnerability to external stimuli. Underlying causes of cerebellar injury remain unclear. In general brain injury is caused by hypoxia-ischemia, infection and inflammation. In this study we analyzed whether postnatal hyperoxia perturbs white matter development in the cerebellum, and whether glial damage can be prevented by minocycline. For our experiments we used a well-established hyperoxia model. Six days old neonatal Wistar-rats (P6) were incubated with 80% oxygen for 24h until P7, followed by recovery in room air. Injections with minocycline were performed at the beginning and 12h during hyperoxia exposure. Hyperoxia induced oxidative stress in the cerebellum indicated by high nitrotyrosine levels. Higher numbers of TUNEL+ oligodendroglial precursor cells (OPC) showed increased apoptosis after high oxygen exposure. Hyperoxia affected OPC proliferation. The number of Ki67+NG2+ OPCs was reduced after exposure to hyperoxia at P7 and after recovering in room air until P11. Hyperoxia resulted in a decreased number of mature CC1+ oligodendroglia, indicating a perturbed maturation. Exposure to hyperoxia reduced the expression of MBP until P30. P30 and P60 MRI measurements and electron microscopy analyses of myelinated fibers at P30 exhibited a reduction of the cerebellar volume and a reduced thickness of the myelin sheath after exposure to hyperoxia from P6 to P7. Immunohistochemical stainings of Iba1 revealed no morphological activation of microglia after hyperoxia exposure. Increased expressions of PDGF-A in cerebellar tissue and cultured astrocytes indicated an impaired glia-glia-crosstalk caused by hyperoxia. The treatment with minocycline during hyperoxia exposure protected the immature cerebellum against white matter damage. We found attenuation of oxidative stress, reduced apoptosis, and improved oligodendroglial proliferation and maturation. MBP expression was improved, cerebellar volume reduction and hypomyelinisation was diminished by minocycline. Impaired glial crosstalk was improved by minocycline. The reduction of PDGF-A gene expression in the cerebellum and in primary astrocytes in cell culture was diminished by minocycline. In conclusion, oxidative stress caused by hyperoxia induces persistent white matter damage in the cerebellum. Treatment with minocycline attenuated the impairment and indicates possibilities of pharmacological prevention with anti-oxidative substances.