Creating a protein-protein interaction network for alpha-synuclein

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer disease. Early in the disease, patients show motor problems including shaking, rigidity, and a slowness of movement. As the disease progresses, cognitive problems like dementia and behavioral problems arise. The two major pathological features of PD are the death of dopaminergic neurons and diffuse accumulation of the alpha-synuclein protein in intracellular aggregates termed Lewy bodies. Three point mutations in the SNCA gene encoding alpha-synuclein have been identified in familial cases of PD. Furthermore, duplication and triplication of the SNCA locus have been found in familial dominant PD cases. A role of alpha-synuclein in the pathogenesis of sporadic PD is implicated by single nucleotide polymorphisms in the SNCA gene that are associated with increased PD risk. Even though a lot of research effort has been devoted to the identification of the precise role of alpha- synuclein in PD pathology, the exact mechanism has not been identified yet. A well-established method for determining the function of a protein of interest is the study of the proteins interacting with it. Although the interaction of alpha-synuclein with numerous proteins has been described in literature, no work aiming to create a comprehensive protein-protein interaction (PPI) network has been published yet. To find out more about the role of alpha- synuclein in the pathogenesis of PD, the yeast two-hybrid (Y2H) assay was used to generate alpha-synuclein PPI networks. Furthermore, two additional PPI detection methods were established and used to identify proteins interacting with alpha-synuclein. The cytosolic yeast two-hybrid (cytoY2H) system was modified for high-throughput use to detect PPIs in the yeast cytoplasm. The subSEQ method combines a cytoY2H cDNA library screen with next-generation sequencing (NGS) to identify interacting proteins. PPIs detected by the Y2H, cytoY2H and subSEQ methods were validated in mammalian cells using the LUMIER co-immunoprecipitation assay. Subsequently, the interaction data obtained by the different detection methods was used to generate a high-confidence alpha- synuclein PPI network. All applied methods detected published as well as novel interaction partners of alpha-synuclein. Many of these proteins could be potential therapeutic targets for PD. Several drugs and small molecules targeting interacting proteins were identified and could be tested for an effect in PD models. Furthermore, the screens detected alpha-synuclein interactions with proteins that are part of signaling pathways inducing neuronal death. The analysis of the generated high-confidence interaction network strongly supports the hypothesis that alpha-synuclein plays an important role in vesicle trafficking. Finally, it was demonstrated that several human proteins interacting with alpha-synuclein modulate its toxicity when overproduced in a yeast model.

Die Parkinson-Krankheit ist nach der Alzheimer-Krankheit die zweithäufigst auftretende neurodegenerative Erkrankung. Zu Beginn der Krankheit treten bei Parkinson-Patienten motorische Störungen wie Muskelzittern, Muskelstarre sowie verlangsamte Bewegungen auf. Im weiteren Verlauf der Krankheit können kognitive Probleme, Demenz und verschiedene Verhaltensprobleme entstehen. Die pathologischen Hauptbefunde der Parkinson-Krankheit sind die Degeneration dopaminerger Neuronen sowie die diffuse Ansammlung des alpha-Synuclein Proteins in intrazellulären Aggregaten, den sog. Lewy-Körperchen. In Familien mit bekannter erblicher Form der Parkinson-Krankheit wurden drei Punktmutationen im SNCA-Gen, welches alpha-Synuclein kodiert, identifiziert. Weiterhin konnten die Duplikation und Triplikation des SNCA-Gens in Familien mit dominant vererbter Parkinson-Krankheit festgestellt werden. Ebenfalls wurden in mehreren Studien genetische Varianten (single nucleotide polymorphisms) des SNCA-Gens mit der sporadischen Form der Parkinson-Krankheit assoziiert. Trotz intensiver Forschung ist die Rolle von alpha-Synuclein bei der Entstehung der Parkinson-Krankheit jedoch noch ungeklärt. Eine gängige Methode um Informationen über die Funktion eines unbekannten Proteins zu erhalten, ist die Identifizierung der Proteine, die mit ihm interagieren. In der wissenschaftlichen Literatur wurden bereits zahlreiche Interaktionspartner von alpha-Synuclein beschrieben. Bis jetzt wurde jedoch noch kein umfassendes Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk für alpha-Synuclein beschrieben. Um mehr über seine Rolle bei Entstehung der Parkinson-Krankheit zu erfahren, wurde in der vorliegenden Arbeit das yeast two-hybrid (Y2H) System verwendet, um neue Interaktionspartner von alpha-Synuclein zu identifizieren. Zusätzlich wurden zwei weitere Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) etabliert und zur Identifizierung von alpha-Synuclein Interaktionspartnern verwendet. Zum einen handelt es sich dabei um das cytosolic yeast two-hybrid (cytoY2H) System. Dieses wurde für den Hochdurchsatz modifiziert und zur Bestimmung von PPIs im Cytoplasma von Hefe verwendet. Zum anderem wurde das subSEQ-System etabliert. Bei dieser Methode wurde ein cytoY2H cDNA-Bank-Screen mit next-generation sequencing (NGS) kombiniert, um interagierende Proteine zu identifizieren. Die durch die o.g. Methoden detektierten Interaktionen wurden in Säugetierzellen mit dem LUMIER Assay validiert. Anschließend wurden alle Interaktionsdaten in ein high-confidence Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk integriert. Durch alle verwendeten Methoden konnten bereits publizierte als auch neue Interaktionspartner von alpha-Synuclein identifiziert werden. Viele dieser Proteine könnten potentielle therapeutische Ziele für die Parkinson- Krankheit darstellen. Weiterhin konnten diverse chemische Moleküle identifiziert werden, die an Modellsystemen für die Parkinson-Krankheit getestet werden können. Durch die Interaktions-Screens konnten Interaktionspartner von alpha-Synuclein identifiziert werden, die als Teil von Signal-Kaskaden den Tod neuronaler Zellen induzieren. Durch die Analyse des high-confidence Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkes von alpha-Synuclein konnte die Hypothese unterstützt werden, dass alpha-Synuclein eine wichtige Rolle beim intrazellulären Vesikeltransport spielt. Außerdem konnte in einem Hefe Modellsystem der Parkinson-Krankheit gezeigt werden, dass viele Interaktionspartner von alpha-Synuclein dessen Toxizität modulieren können.