Comparison of different DNA extraction methods and their impact on telomere length measurement

Abstract

Telomere length is associated with biological age and cellular stress. For example, various studies suggest that chronic diseases, such as atherosclerosis, diabetes mellitus and arterial hypertension, are associated with shorter telomeres in affected patients than in healthy individuals. Yet, it remains unclear how the presumed shortening of telomeres under conditions of stress compares to technical variations, and particularly in terms of the choice of DNA extraction method, which can introduce considerable variation in the resulting measurement of telomere length. This thesis presents a systematic analysis of variation in the measured telomere length within and among five different methods of DNA extraction, as well as among an age-stratified patient cohort.

Blood samples were collected from fifteen individuals and stratified in three age groups of five individuals each. Samples were processed individually as well as pooled by age group, and DNA was extracted using five different methods. All resulting DNA samples were tested for concentration, purity, as well as fragmentation, and telomere length was determined using qPCR, with three technical repeats taken on three consecutive days. Mean values of telomere length and their coefficients of variation were compared both within one extraction method and across extraction methods. Finally, for each method, samples were ranked by mean telomere length.

Among all DNA extraction methods, the Invisorb Blood Universal Kit achieved best results for highly concentrated, pure, and non-fragmented DNA. Technical repeats produced consistent measurements of telomere length with low variation across repeats. The different extraction methods, however, yielded high inter-assay variation of up to 14% on average for individual samples, and an inter-assay variation of up to 11% on average for age-pooled samples. As a consequence of this variation, ranking of the samples by telomer length was inconsistent across different extraction methods.

All considered methods of DNA extraction yielded consistent measurements of telomere length across technical repeats. Comparing measurements of different extraction methods derived from the same blood samples, however, produced significant variations. The choice of DNA extraction method can therefore critically influence the results of a study. In particular, considering that different extraction methods resulted in inconsistent rankings of telomere length across samples, it was shown that samples extracted with different methods cannot be compared with one another. Differences in telomere length observed in studies, such as those in chronically ill patients, may in part be due to the choice of DNA extraction method.

Telomerlänge ist mit dem biologischen Alter und zellulärem Stress assoziiert. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Patienten mit chronischen Krankheiten wie Atherosklerose, Diabetes mellitus und arterieller Hypertonie kürzere Telomere aufweisen als gesunde Individuen. Es bleibt jedoch unklar, wie sich die vermutete Verkürzung der Telomere unter Stressbedingungen verglichen zur technischen Variation verhält. Insbesondere die Wahl der DNA-Extraktionsmethode kann zu erheblichen Variationen bei der Messung von Telomerlängen führen. Diese Arbeit umfasst eine systematische Analyse der Variation der gemessenen Telomerlänge innerhalb und zwischen fünf verschiedenen DNA-Extraktionsmethoden, sowie innerhalb drei verschiedener Altersgruppen.

Von fünfzehn Personen wurden Blutproben entnommen und drei Altersgruppen a fünf Personen zugeteilt. Die Proben wurden sowohl einzeln als auch gepoolt nach Altersgruppen verarbeitet und die DNA mit fünf verschiedenen Methoden extrahiert. Alle DNA-Proben wurden auf Konzentration, Reinheit und Fragmentierung getestet und daraufhin die Telomerlänge mittels qPCR bestimmt. Drei technische Wiederholungen wurden an drei aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Die Mittelwerte der Telomerlänge und ihre Variationskoeffizienten wurden sowohl innerhalb einer Extraktionsmethode als auch zwischen den Extraktionsmethoden verglichen. Zuletzt wurden die Proben nach mittlerer Telomerlänge in eine Rangfolge geordnet.

Von den fünf DNA-Extraktionsmethoden erzielte das Invisorb Blood Universal Kit die besten Ergebnisse für hochkonzentrierte, reine und nicht-fragmentierte DNA. Die technischen Wiederholungen innerhalb einer Methode ergaben konsistente Messungen der Telomerlänge mit geringer Variation zwischen den Wiederholungen. Zwischen verschiedenen Extraktionsmethoden ergab sich dagegen eine hohe Inter-Assay-Variation von bis zu 14 % im Durchschnitt für individuelle Proben und von bis zu 11 % im Durchschnitt für nach Altersgruppe gepoolte Proben. Als Folge dieser Variation resultierte eine inkonsistente Rangfolge der Telomerlänge zwischen den verschiedenen Extraktionsmethoden.

Alle berücksichtigten Methoden der DNA-Extraktion ergaben konsistente Messungen der Telomerlänge in Bezug auf technische Wiederholungen. Jedoch ergab der Vergleich von Telomerlängen verschiedener Extraktionsmethoden aus denselben Blutproben eine signifikante Variation der Telomerlänge. Die Wahl der DNA-Extraktionsmethode beeinflusst somit die Ergebnisse einer Studie. Insbesondere die Tatsache, dass unterschiedliche Extraktionsmethoden zu inkonsistenten Rangfolgen der mittleren Telomerlänge führten, zeigt, dass mit verschiedenen Methoden extrahierte Proben nicht miteinander verglichen werden können. In Studien beobachtete Unterschiede in der Telomerlänge, zum Beispiel bei chronisch kranken Patienten, könnten teilweise auf die Wahl der DNA-Extraktionsmethode zurückzuführen sein.