Hexadecylphosphocholin (Miltefosin) und seine antiparasitäre Wirkung gegen Toxoplasma gondii in Zellkultur und im Mausmodell

Abstract

Das Protozoon Toxoplasma gondii ist ubiquitär verbreitet und verursacht schwerwiegende Krankheitsbilder wie die bei Immunsupprimierten unbehandelt letal verlaufende Toxoplasma-Enzephalitis. Therapie der ersten Wahl ist die Behandlung mit Pyrimethamin-Sulfadiazin bzw. Pyrimethamin-Clindamycin, die mit schweren Nebenwirkungen wie Knochenmarksuppression oder allergischen Reaktionen assoziiert ist und daher häufig wegen Unverträglichkeit abgebrochen werden muss. Neue wirksame Medikamente werden daher dringend benötigt. Für Hexadecylphosphocholin (Miltefosin), das bereits erfolgreich zur Behandlung der Leishmaniose eingesetzt wird, wurde nachgewiesen, dass es ebenfalls gegen zahlreiche verwandte Parasiten wie Trypanosomen, Entamoeben, Acanthamoeben und Cryptosporidien antiparasitäre Wirkung besitzt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun in Zellkultur und am Mausmodell untersucht, ob Miltefosin antiparasitäre Wirkung gegen verschiedene Stadien von T. gondii zeigt. In Zellkultur fand sich unter Miltefosin (30 µg/ml) bei einem Parasiten/Zell- Verhältnis von 1:1 bzw. unter Miltefosin (10 µg/ml) bei einem Parasiten/Zell- Verhältnis von 5:1 nach 3 Stunden Inkubation von GFP-RH Tachyzoiten in J774A.1-Makrophagen eine signifikante Reduktion des Anteils infizierter Makrophagen im Vergleich zu Kontrollen (p<0,005 bzw. p<0,05). Nach längeren Inkubationszeiten (48 und 72 Stunden) bzw. unter anderen Konzentrationen (10 µg/ml, 20 µg/ml und 30 µg/ml) war jedoch kein antiparasitärer Effekt für Miltefosin gegen T. gondii nachweisbar. Stattdessen fand sich zu späteren Untersuchungszeitpunkten paradoxerweise ein Anstieg infizierter Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Nach 72 Stunden Inkubation ergab sich unter Miltefosin (20 µg/ml) in einem Parasiten-Zell-Verhältnis von 1:1 ein Anstieg infizierter Zellen um ca. 50% im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (p<0,01). Im Gegensatz dazu zeigte sich unter Atovaquon (3 µg/ml) nach längeren Inkubationszeiten eine Reduktion T. gondii-infizierter Makrophagen, nach 72 Stunden konnte eine Reduktion infizierten Makrophagen in beiden Parasiten/Zell-Verhältnissen von 1:1 und 5:1 um über 75% im Vergleich zu nicht-behandelten Kontrollen festgestellt werden (p<0,0005). Im Mausmodell der akuten Toxoplasmose zeigte die 5-tägige Miltefosintherapie (30 mg/kg) nach intraperitonealer Infektion von NMRI-Mäusen mit 1x105 GFP-RH Tachyzoiten keine reproduzierbare und signifikante Abnahme der Parasitenlast. Während sich keine Reduktion der T. gondii-DNA-Konzentrationen in den Organen unter Miltefosintherapie im Vergleich zur Kontrollgruppe fand, sanken diese signifikant unter Atovaquon in Lunge, Gehirn, Milz und Leber bzw. unter Pyrimethamin-Sulfadiazin in Lunge und Milz im Vergleich zu Kontrollen (p<0,05). Zwar bestätigte die Immunhistologie in den einzelnen Organen nicht immer die mittels PCR bestimmte Parasitenlast, doch ließen die immunhistologischen Daten ähnliche Rückschlüsse hinsichtlich der antiparasitären Wirkung der einzelnen Medikamente gegenüber T. gondii zu. Auch nach oraler Infektion von NMRI-Mäusen mit 10 ME 49 Zysten und 7-tägiger Miltefosintherapie (20 mg/kg und 30 mg/kg) fand sich kein antiparasitärer Effekt im Mausmodell der akuten Toxoplasmose. Im Modell der latenten Toxoplasmose, in dem NMRI-Mäuse mit 10 ME 49 Zysten i.p. infiziert wurden und 4 Wochen später über 7 bzw. 14 Tage behandelt wurden, deutete sich hingegen ein antiparasitärer Effekt von Miltefosin (30 mg/kg) gegen T. gondii an. Während sich mittels PCR weder unter Miltefosin-, noch unter Atovaquontherapie eine Reduktion der Parasitenlast zeigte, fand sich in der mikroskopischen Untersuchung von Quetschpräparaten für Miltefosin nach 14-tägiger Therapie bzw. unter Atovaquon nach 7- und 14-tägiger Therapie eine signifikante Reduktion der Zystenzahl im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05). Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Miltefosin weder in vitro noch im Mausmodell der akuten Toxoplasmose einen signifikanten antiparasitären Effekt gegen T. gondii zeigt. Da sich im Modell der latenten Toxoplasmose ein antiparasitärer Effekt von Miltefosin andeutete, sollten zukünftige Studien daher im Detail die Wirksamkeit von Miltefosin gegenüber Zysten von T. gondii untersuchen.

Toxoplasma gondii is an ubiquitous protozoan and causes severe clinical manifestations, including toxoplasmic encephalitis (TE), which takes a lethal course if left untreated. The standard therapy includes pyrimethamine plus sulfadiazine or pyrimethamine plus clindamycin, however it is hampered by side effects as bone marrow suppression or allergic reactions often leading to discontinuation of therapy. Therefore, new drugs against TE are strongly required. Hexadecylphosphocholine (miltefosine) has been proven effective in clinical use in patients with leishmaniasis and also showed anti-parasitic activity against other protozoan parasites including Trypanosoma, Entamoeba, Acanthamoeba and Cryptosporidia. In the present doctoral thesis the anti- parasitic effect of miltefosine against different stages of T. gondii in vitro and in vivo was investigated. After infection of J774A.1 macrophages with GFP- RH tachyzoites of T. gondii in vitro a significant decrease of infected cells was observed after 3 hours incubation with miltefosine (30 µg/ml) at a parasite/cell-ratio of 1:1, and with miltefosine (10 µg/ml) at a parasite /cell-ratio of 5:1 in comparison to controls (p<0,005 and p<0,05, respectively). After prolonged incubation periods (48 and 72 hours) or in other concentrations (10 µg/ml, 20 µg/ml and 30 µg/ml) there was no evidence of any anti-parasitic effect of miltefosine; interestingly, there was a paradoxical increase of infected macrophages compared to controls. In contrast, atovaquone used as a therapeutic control agent showed a reduction of infected cells after prolonged incubation periods. After 72 hours incubation with atovaquone (3 µg/ml) percentages of infected macrophages were reduced by about 75% compared to untreated controls (p<0,0005). In a murine model of acute toxoplasmosis NMRI mice were infected intraperitoneally (i.p.) with 1x105 GFP-RH tachyzoites and treated for 5 consecutive days. While drug treatment with miltefosine (30 mg/kg) showed no significant and reproducible reduction in parasitic burden, T. gondii-DNA concentrations significantly decreased after atovaquone treatment in lung, brain, spleen and liver and after pyrimethamine plus sulfadiazine treatment in lung and spleen (p<0,05). Although immunohistologic results did not always correlate with PCR data, similar conclusions could be drawn from the immunohistologic results regarding the drugs’ anti-parasitic activities. Furthermore, miltefosine treatment (20 mg/kg and 30 mg/kg) did not exhibit anti-parasitic activity in another model of acute toxoplasmosis where NMRI mice were infected per-orally with 10 ME 49 cysts of T. gondii and treated for 7 days. In a model of latent toxoplasmosis NMRI mice were treated 4 weeks after i.p. infection with 10 ME 49 cysts for 7 or 14 consecutive days. While T. gondii-DNA concentrations determined by PCR did not significantly differ from controls, after miltefosine or atovaquone treatment, the number of cysts in the brain significantly decreased compared to controls after treatment for 14 days with miltefosine or atovaquone (p<0,05). Therefore, anti-parasitic activity of miltefosine against the cyst stage of T. gondii can not be excluded based on the present studies. In summary, there is no evidence of anti-parasitic activity of miltefosine against T. gondii, neither in vitro nor in vivo in models of acute toxoplasmosis. Because anti-parasitic activity of miltefosine in a model of latent toxoplasmosis could not be excluded, future studies will have to focus on the efficiency of miltefosine against the cyst stage of T. gondii.