Determination of Matrix Metalloproteinases and Interleukin-8 in Bronchoalveolar Lavage Fluid in Horses with Different Lung Diseases

Abstract

The aim of the present study was to investigate the clinical importance of inflammatory markers in the pathogenesis of RAO, chronic interstitial pneumopathy and acute to subacute respiratory infections in horses in parallel with the clinical examination scores, TBS and BALF cytology and pulmonary function testing. To our knowledge, the detection of the concentration of MMP-2 and MMP-9 in BALF by ELISA was the first trial performed in our study and was found to be an easy, accurate and reliable method. In addition, a semi-quantitative densitometry method based on the gelatin zymography bands for estimating the MMP-2 and MMP-9 activity were performed. As the collagen zymography for measuring MMP-8 was impossible to perform; the concentration of MMP-8 was detected in BALF by a fluorescent method. A total of 64 warmblood horses, admitted to the Equine Clinic, Freie Universität Berlin, were used in the present study. Fifteen clinically healthy horses were used as the healthy standard which had no history of respiratory disease and BALF neutrophils percentage ≤8%. Clinical history, physical examination, endoscopy, radiography of the lung and percentage of neutrophils in BALF and TBS were used as the basis for grouping of diseased horses. RAO-affected horses in exacerbation (n=17), in remission (n=18), horses with chronic interstitial pneumopathy (n=11) and horses with acute to subacute respiratory infection (n=3) are the main disease groups studied. The total examination score were increased significantly in diseased horses compared to controls. The percentage of neutrophils in BALF and TBS was correlated with the concentration of MMP-2, MMP-8, MMP-9 and IL8 and this support the role of these inflammatory markers in the pathogenesis of lung disease. MMP-2 concentration was significantly increased in RAO-affected horses in exacerbation (5.21±0.77 ng/ml) and remission (7.67±15.5 ng/ml) compared to clinically healthy horses (2.49±0.83 ng/ml). MMP-9 concentration was significantly increased in RAO-affected horses in exacerbation (433.34±89.05 pg/ml), remission (312.06±23.92 pg/ml) and horses with chronic interstitial pneumopathy (263.2±23.85 pg/ml) compared to healthy horses (176.29±60.22 pg/ml). These results were confirmed by zymography for MMP-2 and MMP-9 activity in 55 horses. MMP-8 concentration was also significantly increased in RAO-affected horses in exacerbation (0.84±1 μmol/l), remission (0.1±0.06 μmol/l) and horses with chronic interstitial pneumopathy (0.02±0.01 μmol/l) compared to healthy individuals (0.01±0.01 μmol/l) as evaluated by fluorescent method. BALF neutrophil percentage showed a high positive correlation with the concentration of MMP-2, MMP-8 and MMP-9. Also, a highly positive correlation was found with the MMP-2 and MMP-9 activity measured by gelatin zymography. These results were suggestive for its role in the pathogenesis of lung disease. In addition, IL-8 was significantly increased in RAO-affected horses in exacerbation and remission. The observations of the present study provide new insights into the diagnostic potential of various biomarkers in equine airway disease and could be used as an important tool for detecting lung tissue remodeling. Further studies should be focused on the role of TIMPs as a therapeutic approach.

Ziel der vorliegenden Studie war es, die klinische Bedeutung verschiedener Entzündungsmarker in der Pathogenese der Recurrent Airway Obstruction (RAO) in Exazerbation und Remission, der chronischen interstitiellen Pneumopathie und akuter bis subakuter Infektionen der tiefen Atemwege bei Pferden auf eine Korrelation zu den Ergebnissen der klinischen Untersuchung, Tracheobronchialsekret (TBS) und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) Zytologie und Tests zur Lungenfunktion zu untersuchen. Soweit wir wissen, wurden die Konzentrationen von MMP-2 und MMP-9 im Rahmen dieser Studie erstmals mittels ELISA ermittelt und diese Methode erwies sich als einfach, akkurat und zuverlässig. Außerdem erfolgte eine semi-quantitative densitometrische Auswertung der Banden der Gelatin-Zymographie zur Abschätzung der Aktivitäten von MMP-2 und MMP-9. Da sich die Kollagen-Zymographie zur Bestimmung der MMP-8 als wenig praktikabel erwies, erfolgte die Auswertung der MMP-8 in der BALF fluorimetrisch. Insgesamt wurden 64 Warmblüter an der Klinik für Pferde, Allgemeine Chirurgie und Radiologie der Freien Universität Berlin im Rahmen dieser Studie untersucht. 15 dieser Pferde waren vorberichtlich und klinisch gesund, der Anteil der neutrophilen Granulozyten in der BALF lag ≤ 8% und sie dienten somit als gesunde Kontrollgruppe. Die Ergebnisse der Vorberichtserhebung, der klinischen, endoskopischen und röntgenologischen Untersuchungen, der Lungenfunktionstests und der zytologischen Untersuchunen von TBS und BALF dienten der Einordnung der Probanden in die verschiedenen Erkrankungsgruppen: RAO in Exazerbation (n=17), RAO in Remission (n=18), chronisch interstitelle Pneumopathie (n=11) und akute bis subakute Atemwegsinfektionen (n=3) Der Gesamtuntersuchungsscore war bei den erkrankten Pferden gegenüber den gesunden Kontrolltieren signifikant erhöht. Der Anteil neutrophiler Granulozyten in TBS und BALF korrelierte mit den Konzentrationen von MMP-2, -8, -9 und IL-8, was die Rolle dieser Entzündungsmarker in der Pathogenese equiner Pneumopathien unterstützt. Die MMP-2 Konzentration war bei RAO in Exazerbation (5,21 ± 0,77 ng/ml) und Remission (7,67 ± 15,5 ng/ml) gegenüber der Kontrollgruppe (2,49 ± 0,83 ng/ml) signifikant erhöht. Die MMP-9 Konzentration war bei RAO in Exazerbation (433,34 ± 89,05 pg/ml), RAO in Remission (312,06 ± 23,92 pg/ml) sowie den chronisch interstiellen Pneumopathien (263,2 ± 23,85 pg/ml) gegenüber der Kontrollgruppe (176,29 ± 60,22 pg/ml) signifikant erhöht. Diese Ergebnisse wurden für die MMP-2 und -9 in 55 BALF Proben zymographisch bestätigt. Die MMP-8 Konzentration war bei RAO in Exazerbation (0,84 ± 1 μmol/l), RAO in Remission (0,1 ± 0,06 μmol/l) sowie den chronisch interstiellen Pneumopathien (0,02 ± 0,01 μmol/l) gegenüber der Kontrollgruppe (0,01 ± 0,01 μmol/l) fluorimetrisch signifikant erhöht. Der Anteil neutrophiler Granulozyten in der BALF zeigte eine hochsignifikante positive Korrelation zu den zymographisch gemessenen Aktvititäten von MMP-2 und -9, was die Bedeutung der gelatinolytischen Aktvität bei verschiedenen Pneumopathien des Pferdes unterstützt. Außerdem war IL-8 signifikant erhöht bei RAO in Exazerbation und Remission. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ermöglichen neue Einblicke in eine mögliche diagnostische Verwendung verschiedener Biomarker bei equinen Atemwegserkrankungen und diese könnten genutzt werden, um Umbauprozesse in der pulmonalen extrazellulären Matrix besser einschätzen zu können. Weitere Studien sollten sich mit der Rolle der natürlichen Inhibitoren der MMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) als mögliche Therapieoption beschäftigen.