Funktionelle Bedeutung des Lipidperoxidstoffwechsels bei der Erythropoese

Abstract

Introduction: The Glutathione peroxidase 4 (Gpx4) and the 12/15-Lipoxygenase (ALOX15) are functional adversaries in the metabolism of oxygenated lipids. Hydroperoxylipids are essential activators for the catalytic activity of ALOX15. Since Gpx4 reduces the peroxides, it indirectly inhibits ALOX15. Gpx4 plays a dual biological role. It functions as catalytically active enzyme but it is also a structural protein. ALOX15 and Gpx4 have been implicated in the maturation and differentiation auf the red blood cells. Conditional knock-out of the Gpx4 gene in hematopietic cells induced defective erythropoiesis. In contrast, Alox15-/- mice develop normally and all major hematopoietic parameters were normal. Methodology: In order to further investigate the potential roles of the two enzymes in erythropoiesis we developed a cellular in vitro model, in which the expression of Gpx4 was significantly reduced employing the RNAi strategy. To test the in vivo role of Alox15 and Gpx4 during erythropoiesis we developed different genetically modified mouse models. First we analysed the impact of systemic homozygous inactivation oft he Alox15 gene (Alox15-/-) on in vivo erythropoiesis. We also analysed Gpx4 knock-in mice (Gpx4U46A/+) that heterouzygously expressed an inactive mutant of the enzyme. Next, wie explored the erythropoiesis of mice carrying a defective Alox15 gene and in addition Gpx4 knock-in allele (Alox15-/-+Gpx4U46A/+). Finally, we expressed a transgenic human ALOX15 in Alox15-/- mice under the control of the aP2 promotor and tested the erythropoiesis of these animals. Results: A stable knockdown of the Gpx4 expression in MEL cells in vitro leads to a reduced mRNA expression of selected erythroid specific genes including hemoglobin. In vivo Alox15-/- mice exhibit significantly reduced erythrocyte counts with compensatory increase in reticulocyte number. Erythrocytes were hyperchromic and the share of echinocytes/acanthocytes was increased. Osmotic resistance was impaired and the ex vivo life span reduced. While Gpx4U46A/+ mice presented no abnormalities in the hematopoietic system, similar changes were observed in Gpx4U46A/++Alox15-/- mice. Conclusions: Taken together this data suggests that a reduction of the Gpx4 expression in MEL cells leads to defective in vitro erythropoiesis. In vivo heterozygous expression of catalytically inactive Gpx4 is not sufficient to compromise erythropoiesis. On the other hand, systematic inactivation of the Alox15 gene (Alox15-/- mice) induces a defective erythroid phenotype characterized by structural and functional defects of red blood cells. Similar abnormalities were shown in Alox15-/-+Gpx4U46A/+ mice. Transgenic expression of human ALOX15 in Alox15-/- mice (Alox15-/-+aP2 ALOX15) recues the defective erythroid phenotype shown for Alox15-/- mice.

Einleitung: Die Glutathionperoxidase 4 (Gpx4) und die 12/15 Lipoxygenase (Alox15) sind funktionelle Gegenspieler im Stoffwechsel oxygenierter Lipide. Durch die Reduktion von Hydroperoxylipiden, die als Aktivatoren der Alox15 essenziell für deren katalytische Aktivität sind, wirkt die Gpx4 als indirekter Alox15 Hemmstoff. Gleichzeitig fungiert die Gpx4 auch als Strukturprotein, welches eine wichtige Rolle bei der Bildung der mitochondrialen Kapsel im Rahmen der Spermatogenese spielt. Beide Proteine wurden in früheren Untersuchungen mit der Reifung und Differenzierung roter Blutzellen (Erythropoese) in Verbindung gebracht. Während ein erythroid-spezifischer Knockout des Gpx4 Gens deutliche phänotypische Veränderungen bei der Entwicklung roter Blutzellen induzierte, zeigten Alox15-/- Mäuse keine markanten hämatopoetischen Veränderungen. Methodik: Um die Auswirkungen der beiden Enzyme auf die Erythropoese bei Mäusen weiter zu erforschen, nutzten wir im ersten Teil der vorliegenden Arbeit zunächst ein stabiles RNAi-Zellmodell, bei dem die Expression des Gpx4 Gens deutlich verringert wurde. Um die Rolle von Alox15 und Gpx4 für die in vivo Erythropoese zu testen, verwendeten wir im zweiten Teil der Arbeit verschiedene Mausmodelle. So untersuchten wir die Hämatopoese in homozygoten Alox15 Knockout Tieren (Alox15-/- ). Zudem analysierten wir Gpx4 Knockin Mäusen (Gpx4U46A/+ ), die heterozygot eine katalytisch inaktive Mutante des Enzyms exprimierten. Weiterhin untersuchten wir Mäuse mit einem zusätzlichen homozygoten Alox15 Knockout (GpxU46A/++Alox15-/- ) sowie Tiere, die neben dem homozygoten Alox15 Knockout (Alox15-/- ) transgen die humane ALOX15 (Alox15-/-+aP2-ALOX15) exprimierten. Ergebnisse: In vitro führte ein stabiler Knockdown der Gpx4 Expression in murinen Erythroleukämie Zellen (MEL-Zellen) zu einer verminderten Expression Erythropoese relevanter Gene und zu einer reduzierten Hämoglobinsynthese. In vivo zeigten Alox15-/- Mäuse eine signifikante Reduktion der Erythrozytenzahl mit kompensatorischem Anstieg der Retikulozytenzahl. Weiterhin waren die Erythrozyten dieser Tiere hyperchrom und wiesen neben vermehrten Echinozyten/Akanthozyten auch eine reduzierte osmotische Stabilität sowie eine verringerte ex vivo Überlebensrate auf. Während Gpx4U46A/+ Mäuse keine Auffälligkeiten im hämatopoetischen System zeigten, konnten ähnliche Veränderungen auch bei Gpx4U46A/++Alox15-/- Mäusen aufgezeigt werden. Schlussfolgerung: Aus diesen Daten kann zusammenfassend geschlussfolgert werden, dass die Reduktion der Gpx4 Expression in MEL-Zellen zu einer defekten Erythropoese führt. Im Gegensatz dazu konnte bei Gpx4U46A/+ Mäusen keine defekte Erythropoese nachgewiesen werden. Eine systemische Inaktivierung des Alox15 Gens induzierte einen defekten erythropoetischen Phänotyp, der durch strukturelle und funktionelle Abnormalitäten der roten Blutzellen gekennzeichnet war. Ähnliche Auffälligkeiten wurden auch bei Alox15 defizienten Mäusen gezeigt, in die eine funktionelle Gpx4 Defizienz (Gpx4U46A/++Alox15-/- ) eingekreuzt wurde. Die transgene Expression der humanen ALOX15 in Tieren mit homozygotem Alox15 Knockout hingegen (Alox15-/-+aP2 ALOX15) führt zu einem rescue des erythroiden Phänotyps.