Charakterisierung der Immunantwort auf Tumore nach regionaler Hyperthermie im Mausmodell des malignen Melanoms

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob regionale Hyperthermie von Melanomen eine spezifische Immunantwort auf diesen Tumor induzieren oder verstärken kann, um Ansatzpunkte für eine Kombination aus Hyperthermie und Immuntherapie zu entwickeln. Als Modell wurde das murine B16F0-Melanom der C57L/6 Maus gewählt.

Wurden die B16F0 Zellen bei 43°C hyperthermiert, so starb 1/5 der Zellen apoptotisch und nekrotisch. Dendritische Zellen phagozytierten den Debris der hyperthermierten B16F0 Zellen, in welchem nach Hyperthermie verstärkt gebildete Hitzeschockproteine nachweisbar waren. Die daran gebundenen Peptide nach Hyperthermie abgebauter Antigenen können von den Dendritischen Zellen an T-Zellen präsentiert werden. Da Dendritische Zellen durch Hitzeschockproteine aktiviert werden, können sie wiederum peptidspezifische-Zellen aktivieren.

Im Mausmodell der regionalen Hyperthermie konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch weder ein reduziertes Wachstum etablierter B16F0 Melanome nach Hyperthermie, noch Effekte auf die T-Zell-Antwort gegen den Tumor nachgewiesen werden. Daher wurde im folgenden untersucht, ob die Hyperthermie die Bildung und die Präsentation antigener Peptide beeinflußigt, um so die Frage zu beantworten, ob die Stimulation einer T-Zell-Reaktion durch regionale Hyperthermie möglich ist.

In Zelkultur-Experimenten konnte gezeigt werden, daß die Transkription des Modellantigens Tyrosinase nach Hyperthermie erniedrigt, aber nicht vollständig inhibiert ist. Vorhandene Tyrosinase wurde proteasomal abgebaut, so daß von der Produktion antigener Peptide dieses wichtigen T-Zell-Antigens von Melanomen ausgegangen werden konnte. Es konnte zudem gezeigt werden, daß B16F0 Zellen konstitutiv keine der beiden Untereinheiten des TAP Transporters bilden, der die antigenen Peptide in das endoplasmatische Retikulum transportiert. Bei Analyse des tap-1-Promotors wurde ein Hitzeschockelement gefunden, das nach Hyperthermie die Transkription von tap-1 induziert.

Neben der Expression des TAP Transporters wurde auch die Expression von MHC-I Komplexen auf der Membran untersucht. Nach Hyperthermie war keine MHC-I Expression bei den konsitutiv MHC I-negativen B16F0 Zellen nachzuweisen. Stimuliert man B16F0 Zellen mit IFN-gamma, so exprimieren sie MHC I Komplexe auf der Zellmembran. Werden die Zellen unmittelbar vor oder nach der IFN-gamma Stimulation hyperthermiert, ist die MHC I-Präsentation leicht erniedrigt, doch weiterhin nachweisbar. Daher sollte eine IFN-gamma Therapie bei responsiven Tumoren mit MHC I Defizienz die Präsentation der gebildeten T-Zell-Peptide auf den Tumorzellen induzieren. Tumorspezifische T-Zellen, die nach Hyperthermie von Dendritischen Zellen aktiviert wurden, können diese Tumorzellen erkennen und lysieren. Zudem wäre eine lokale Therapie des Tumors mit dem Zytokin GM- CSF unmittelbar nach Hyperthermie sinnvoll, das die Migration von Dendritischen Zellen in den Tumor induziert, um die Aufnahme von Tumorzelldebris nach Hyperthermie zu verstärken.

In this project the effect of regional hyperthermia on the specific immunity against melanoma is analysed. The aim was, to utilise possible interactions in a combination of hyperthermia and immunotherapy. The murine B16F0-melanoma of the C57BL/6 mouse was chosen as a model.

About 1/5 of B16F0 cells died apoptotic and necrotic upon hyperthermia. Dendritic cells took up the resulting cell debris of treated B16F0 cells, in which increased levels of heat shock proteins could be detected. Peptides, which are derived by degraded Proteins after hyperthermia and are known to be bound to these heat shock proteins, can therefore be presented to T-cells by Dendritic cells. The Dendritic cells themselves are known to be activated by heat shock proteins, and can so activate specific T-cells.

Despite this, in a mouse model of regional hyperthermia neither growth reduction of establilshed B16F0 tumors nor an effect on the immune reaction against could be found after hyperthermia. Therefore the formation and presentation of antigenic peptides after hyperthermia was analysed.

In cell culture experiments it could be shown that the transcription of tyrosinase, a major melanoma antigen, is decreased, but not totally abolished. Existing tyrosinase was degraded by proteasomes, resulting in the formation of antigenic peptides after hyperthermia. It could also be shown, that B16F0 cells did not express both subunits of the TAP transporter, which transports antigenic peptides into the endoplasmic reticulum. In the tap 1 promotor a heat shock element could be found, which induces the tap 1 transcription upon hyperthermia.

The expression of MHC-I complexes on the cell membrane was also analysed. After hyperthermia the MHC-I negative B16F0 cells did still not express MHC-I complexes. Upon stimulation with gamma-IFN, MHC-I presentation on the cell membrane can be detected. Hyperthermia immediately before or after gamma-IFN stimulation did slightly reduce but not abolish MHC-I presentation. Therefore gamma-IFN treatment should in responsive MHC-I deficient tumors induce the presentation of newly formed T-cell antigens. Tumorspecific T cells, which have been activated by Dendritic cells after hyperthermia can recognise and lyse these tumor cells. An additional local therapy of the tumor with GM-CSF immediately after hyperthermia could be useful, resulting in the migration of Dendritic cells into the tumor and increased uptake of tumor cell debris by these cells.