Expression and function of the let-7 microRNA during stem cell specification and development of the CNS

Abstract

Contemporary biology has undergone a small revolution with the discovery of microRNAs (miRNAs), a class of 22 nucleotide regulatory RNAs. miRNAs are endogenously expressed, non-coding RNAs that inhibit the translation of target mRNAs by binding to cognate sites of imperfect complementarities found in 3’ untranslated regions. In the past eight years, a rapidly expanding literature has begun to document the importance of this new mechanism in the regulation of eukaryotic gene expression. To date, thousand of miRNA genes have been identified by a combination of cloning, direct sequencing and bioinformatic techniques. Computational analysis suggests that the total number of miRNA genes may be more than 1% of total protein coding genes. Experimental data and computational algorithms suggest that each miRNA may potentially target many different (ten to hundreds) mRNAs, taken collectively this indicates that over 30% of all genes may be regulated by miRNAs. By targeting the mRNA of protein- coding genes miRNAs play a critical role in a variety of biological processes like development, cell growth, proliferation, lineage determination and metabolism. miRNAs have also been implicated in the etiology of a variety of complex diseases like Fragile X syndrome, Tourette’s syndrome, Alzheimer’s disease, neurodegenerative diseases and a large number of cancers with different origins. miRNAs are also crucial components of the gene regulation machinery that controls nervous system development and neural stem cell differentiation. The nervous system is a rich source of miRNA expression. Over 70% of experimentally detected miRNAs are expressed in the brain. Unfortunately, to date too little is known about the role of individual miRNAs in neural development and nervous system function. In this context, the principal goal of this work was to investigate the expression and function of the let-7 miRNA family during development of the CNS as well as during neural stem cell differentiation. The study focussed on the analysis of let-7 expression, the identification of novel let-7 target genes and their functional analysis. Using in situ hybridization (ISH) in E9.5 mouse embryos, early induction of let-7 in the developing central nervous system was demonstrated. The expression pattern of three let-7 family members closely resembled that of the brain-enriched miRNAs mir-124, mir-125 and mir-128, and was most prominent in the neuroepithelium of the brain and spinal cord, and in the cranial and dorsal root ganglia. To identify genes regulated by let-7, microarray profiling of mRNA after ectopic expression of let-7 in EC cells was performed. A majority of the most highly downregulated genes corresponded to direct let-7 targets, as predicted by miRNA binding sites algorithms: TargetScan and PicTar. GO annotations suggest a statistically significant clustering of transcription factors and translational regulators. Three novel stemness genes (hic2, arid3b and mlin-41) were identified as candidate targets for let-7 during embryonic development. Detailed analysis of mLin-41 and let-7 expression patterns revealed a reciprocal relationship in several pluripotent or multipotent cell environments: embryonic stem cells, the embryonic epiblast, the male and female germlines and skin. Functional analysis revealed that mLin-41 is a novel component of cytoplasmic P-bodies and that has E3 ubiquitin ligase activity. Moreover, the mechanisms regulating let-7 miRNA expression during stem cell commitment were characterized. It was shown that a pluripotent factor, Lin-28, directly interacts with the pre-let-7 miRNA and blocks cytoplasmic let-7 miRNA processing in undifferentiated stem cells. Lin-28 itself is a regulatory target of the let-7 and mir-125 microRNAs, which indicate both let-7 and Lin-28 act in an autoregulatory pathway to control miRNA processing during neural stem cell differentiation.

Die Entdeckung der microRNA(miRNAs), eine Gruppe von ca. 22 Nukleotid langen regulatorischen RNAs, hat zu einer kleinen Revolution in der Biologie geführt. miRNAs sind endogen exprimierte, nicht kodierende RNAs, welche an bestimmte RNA-Sequenzabschnitte in der 3’UTR von mRNAs binden und deren Translation inhibieren. In den letzten acht Jahren sind zahlreiche Publikationen erschienen, die die Bedeutung dieses neuen eukaryotischen posttranskriptionellen Regulationsmechanismus dokumentieren. Unter Zuhilfename neuester Klonierungsmethoden, direct sequencing und der Bioinformatik konnten tausende miRNA-Gene identifiziert werden. Durch experimentelle Daten und bioinformatische Algorithmen kann angenommen werden, dass jede miRNA zehn bis hunderte verschiedene mRNAs inhibieren kann und die Expression von 30% aller proteinkodierenden Gene durch miRNAs moduliert werden. Durch die Inhibierung verschiedenster mRNAs spielen miRNA eine kritische Rolle in diversen biologischen Prozessen, wie Entwicklung, Zellwachstum, Proliferation, Differenzierung von Zell- oder Gewebetypen und Stoffwechselprozessen. Dysfunktionen von miRNAs können auch verschiedene Krankheiten zur Folge haben wie zum Beispiel Martin-Bell-Syndrom, Touret Syndrom, Alzheimer, Neurodegeneration sowie Karzinome unterschiedliche Ursprungs. Während der Neuronalen Stammzelldifferenzierung und der Entwicklung des Nervensystems spielen miRNA eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Der Haupteil der miRNAs wird im Nervensystem expremiert. Über 70% der bis dato experimentell entdeckten miRNAs werden im Gehirn exprimiert. Bis jetzt ist allerdings wenig über deren Rolle für die neuronale Entwicklung und Funktion bekannt. In diesem Zusammenhang lag das Hauptziel der hier vorliegenden Arbeit darin, die Expression und Funktion der let-7 mikroRNA Familie während der neuronalen Stammzelldifferenzierung und der Entwicklung des Nervensystems eingehender zu untersuchen. Dabei wurde neben der let-7 Expression Zielgene und deren Funktion analysiert. Mittels whole mount in situ Hybridisierung an E9.5 Embryonen von Mäusen konnte eine frühe Induktion von let-7 im entwickelnden ZNS gezeigt werden. Das Expressionsmuster von drei der let-7 Familie zugehörigen miRNAs ähnelte dabei stark den im Gehirn angereicherten miRNAs mir-124, mir-125 und mir-128. Es konnte eine starke Expression im Neuroepthelium des Gehirns, im Rückenmark sowie im Somatischen Ganglien gezeigt werden. Um Gene identifizieren zu können, welche von let-7 reguliert werden, wurde mRNA aus embryonalen Karzinom Zellen vor und nach ektopischer Expression isoliert und eine Microarray Analyse durchgeführt. Ein Großteil der am stärksten herunterregulierten Gene waren von TargetScan und PicTar vorhergesagte let-7 Zielgene. GO Annotationen zeigten, das es sich bei den meisten Zielgenen um Transkriptionsfaktoren und Tanslationsregulatoren handelt. Dabei konnten u.a. hic2, arid3b und mlin-41 als potentielle Zielgene welche von let-7 während der Embryonalentwicklung reguliert werden, identifiziert werden. Eine detaillierte Analyse von mLin-41 und dem let-7-Expressionmuster wies eine reziproke Verteilung in verschieden pluripotenten und multipotenten Zelltypen wie embryonalen Stammzellen, embryonalem Epiblasten, der Haut sowie der männlichen und weiblichen Keimbahn auf. Funktionelle Analysen konnten mLin-41 als eine neue Komponente der zytoplasmatischen P-Bodies identifizieren. Darüber hinaus zeigt mLin-41 eine E3 Ubiqitin Ligase Aktivität. In dieser Arbeit konnte darüberhinaus ein Mechanismus, welcher postranskriptionel die Expression von let-7 steuert aufgedeckt werden: Lin-28 interagiert direkt mit der pre-let-7 miRNA und verhindert so die let-7 Prozessierung in undifferenzierten Stammzellen. Lin-28 konnte wiederum als let-7 Zielgen identifiziert werden. Somit wird die let-7 Prozessierung durch einen autoregulatorischem feed-back Mechanismus von Lin-28 und let-7 während der neuronalen Stammzelldifferenzierung gesteuert.