Effect of L-methionine on RBCs metabolism during storage

Abstract

Packed Red blood cells (RBCs) remain the most widely transfused blood component in the clinical setting. For clinical purposes, erythrocyte concentrate can be stored at 4 ± 2° C, for up to 42 days. However, their storage under blood banking conditions is associated with deleterious morphological and metabolic alterations, so called “storage lesions”, which have a negative effect on the quality of stored RBCs. Application of omics technology in transfusion medicine significantly improved the study of RBC storage lesions. Metabolomics analysis showed a dramatic decrease in methionine concentration in stored RBCs, while homocysteine level increased [1]. Methionine is an essential methyl donor for several metabolic reactions, such as regulation of glycolytic enzymes, synthesis of glutathione and conversion of phosphatidylethanolamine (PE) to phosphatidylcholine (PC). Methionine can be generated either by homocysteine and betaine, or by homocysteine and 5’-methyltetrahydrofolate (5’-MTHF). The latter reaction uses Cobalamin (vitamin B12) as a cofactor. Based on this finding, we attempted to restore the methyl-group pool in stored RBCs by supplementation of L-methionine, or to convert the accumulated homocysteine into methionine by supplementation of 5’-MTHF and vitamin B12. Study Design and Methods: A pool- and-spilt design of leukodepleted RBCs stored in PAGGS-M additive solution was carried out to obtain three identical groups for PAGGS-M (control), PAGGS-MM (supplemented with L- methionine) and PAGGS-MB (supplemented with 5’-MTHF and vitamin B12). RBC units were stored at 4° C for up to 42 days and assessed for complete blood count, blood gas analysis, ATP, 2, 3 DPG, NAD/NADH, NADP/NADPH and total GSH and GSSG levels, hemolysis rate and extracellular metabolomics on a weekly basis. Results: Supplementation of L-methionine significantly reduced the hemolysis rate and activity of PPP in packed RBCs throughout the storage period. However, the hemolysis rate was lower at the beginning of storage, rather than the end of storage period. RBCs stored in PAGGS-MM additive solution demonstrated the highest MCV, which was not related to cation leakage. The metabolic fate of supplemented methionine was substantially shifted towards transamination pathway. Unlike L methionine, supplementation of 5’-MTHF + B12 had neither a beneficial, nor a harmful effect on stored RBCs Conclusion: Reduced hemolysis rate and activity of PPP in RBCs stored PAGGS-MM, can be the consequences of decreased oxidative stress. Higher MCV of RBCs caused by L-methionine supplementation may be related to lower vesiculation of RBC membrane. Transamination of L-Methionine may prevent RBCs from accumulation of homocysteine. In vivo study is needed to estimate the effect of L-methionine on stored RBCs.

Erythrozytenkonzentrate (EKs) sind immer noch die am häufigsten transfundierten Komponenten im klinischen Alltag. Klinisch zu nutzende EKs können bei 4 ± 2° C für bis zu 42 Tage gelagert werden. Eine solche Lagerung, selbst unter stringenten Blutbank-Bedingungen, führt jedoch bisher immer zu morphologischen und metabolischen Veränderungen, den sogenannten Lagerungsschäden, die einen negativen Effekt auf die Qualität der EKs haben. Der Einsatz der omics-Technologie in der Transfusionsmedizin konnte die Untersuchungen zu Lagerungsschäden signifikant verbessern. Die metabolische Analyse zeigte einen dramatischen Abfall der Methionin Konzentration in den gelagerten Erythrozyten, während das Homozystein-Niveau anstieg [1]. Methionin, als ein wesentlicher Methyldonor, ist für eine Vielzahl von metabolischen Reaktionen wichtig, wie z.B. der Regulierung von Glykolyse- Enzymen, der Synthese von Gluthathion und der Umwandlung von Phosphatidylethanolamin (PE) zu Phosphatidylcholin (PC). Methionin kann entweder durch Homozystein und Betain, oder durch Homozystein und 5’-Methyltetrahydrofolat (5’-MTHF) generiert werden. Die letztgenannte Reaktion nutzt Cobalamin (Vitamin B12) als Kofaktor. Ausgehend von diesen Ergebnissen wollten wir versuchen, den Methylgruppenpool in gelagerten Erythrozyten durch die Ergänzung mit L-Methionin aufzufüllen, oder durch Zugabe von 5’-MTHF und Vitamin B12 das akkumulierte Homozystein in Methionin zu konvertieren. Studiendesign und Methoden: Ein pool-and-split-Design von leukozytendepletierten Erythrozyten in PAGGS-M Lösung wurde genutzt, um drei identische Gruppen für PAGGS-M (Kontrolle), PAGGS-MM (Zugabe von L-Methionin) und PAGGS-MB (Zugabe von 5’-MTHF und Vitamin B12) zu erhalten. Die Erythrozyten wurden anschließend bei 4°C für bis zu 42 Tage gelagert und in dieser Zeit wöchentlich auf ihre Gesamtzellzahl, ATP-, 2,3-DPG-, NAD/NADH-, NADP/NADPH- Konzentrationen, die Menge an Gesamt- und oxidiertem Gluthation und ihre Hämolyserate untersucht. Des Weiteren wurden Blutgasanalysen und extrazelluläre Metabolomics-Untersuchungen durchgeführt. Ergebnisse: Die Zugabe von L-Methionin reduzierte signifikant die Aktivität des PPP und die Hämolyserate in Erythrozytenkonzentraten, auch wenn die Rate im Vergleich zum Ausgangswert während der Lagerung anstieg. Erythrozyten, die in PAGGS-MM gelagert wurden, zeigten die höchsten MCV-Werte. Dies war nicht assoziiert mit dem Verlust von Kationen. Das metabolische Schicksal des zugegebenen Methionins wurde in erheblichem Maße in Richtung des Transaminase-Weges verschoben. Im Gegensatz zum L-Methionin, hatte die Zugabe von 5‘-MTHF + B12 weder einen positiven noch negativen Effekt. Zusammenfassung: Die Reduktion der Hämolyserate und der Aktivität des PPP in Erythrozyten, die in PAGGS-MM gelagert wurden, kann eine Folge von vermindertem oxidativen Stress sein. Der signifikant höhere MCV der Erythrozyten unter L-Methionin-Zugabe könnte mit der geringeren Vesikulierung der Membran zusammenhängen. Die Transaminierung von L-Methionin könnte die Erythrozyten vor einer Akkumulierung von Homocystein schützen. In vivo- Studien sind unabdingbar, um den Effekt von L-Methionin auf gelagerte Erythrozyten einschätzen zu können.