Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der AAA+ ATPasen Pontin und Reptin

Abstract

Pontin und Reptin sind die beiden einzigen Vertreter der hochkonservierten Tip49-Subfamilie der AAA+-ATPasen in Eukaryoten. Sie zeichnen sich durch ihre besondere Domänenstruktur und ihre essentielle Beteiligung an einer Vielzahl biologischer Prozesse aus. So sind Pontin und Reptin an der Assemblierung von snoRNPs und der Telomerase beteiligt. Zusätzlich sind beide Proteine essentielle Bestandteile verschiedener Chromatin-Remodelling-Komplexe. Durch die Regulation der Transkription verschiedener potentiell onkogener Faktoren, wie beta-Catenin und c-Myc, sind Pontin und Reptin entscheidend an Prozessen der humanen Kanzerogenese beteiligt. In dieser Arbeit wurde das Tumorsuppressorprotein Fhit als neuer direkter Interaktionspartner von Pontin und Reptin identifiziert. Dabei konnte die Bindung von Fhit im Bereich der Aminosäuren 67-148 von Pontin und 1-147 von Reptin kartiert werden. Diese Bereiche binden keine bisher bekannten direkten Interaktionspartner von Pontin und Reptin, wie zum Beispiel beta-Catenin, Hint1 oder c-Myc. Die Analysen der Effekte von Pontin oder Reptin und Fhit auf beta-Catenin-aktivierbare Reportergene zeigten, dass Pontin die reprimierende Wirkung von Fhit einschränkte, Reptin diese jedoch verstärkte. Durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie konnte eine Co-Lokalisation von Pontin, Reptin und Fhit im Nukleus verschiedener Zelllinien nachgewiesen werden. Durch ChIP und Re-ChIP Analysen konnte die Bildung gemeinsamer Komplexe von Pontin, Reptin oder beta-Catenin und Fhit an Promotorbereiche der Wnt-Zielgene CyclinD1 und MMP-14 nachgewiesen werden. Da diese Befunde eine Beteiligung von Fhit an Prozessen des Chromatin-Remodelling nahe legten, wurde mit Hilfe von Immunpräzipitationen nachgewiesen, dass Fhit, Pontin und Reptin in gemeinsamen Komplexen mit der Histon-Aceytltransferase Tip60 vorliegen. Weitere Interaktionsassays mit gereinigten, rekombinanten Proteinen zeigten, dass Fhit und Tip60 direkt miteinander interagieren. Diese Befunde deuten auf eine neue Funktion von Fhit im Tip60-Chromatin-Remodelling-Komplex hin. Bei den immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zur intrazellulären Lokalisation von Pontin konnte neben der nukleären auch eine punktuelle Färbung im Nukleolus nachgewiesen werden. Bei der weiteren Untersuchung dieser Befunde konnte für Pontin gezeigt werden, dass es Zellzyklus-abhängig im Nukleolus akkumuliert, dort in gemeinsamen Komplexen mit RNA-Polymerase I in den fibrillären Zentren vorliegt und zusammen mit c-Myc an regulatorische Elemente der chromosomalen DNA in den rRNA-Gen-Clustern bindet. Die Befunde deuten darauf hin, dass Pontin als wichtiger Co-Aktivator von c-Myc und RNA- Polymerase I an der Regulation der rRNA-Synthese beteiligt ist.

Pontin and Reptin are the two only representatives of the Tip49 subfamily of AAA+-ATPases in eukaryotes. They are characterized by their unique domain structure and by their essential participation in a multitude of biological processes. Pontin and Reptin participate in the assembly of snoRNPs and telomerase. In addition, they are both essential components of several chromatin-remodelling-complexes. Through their regulation of different oncogenic factors like beta-Catenin und c-Myc, Pontin and Reptin are critically involved in processes of human cancerogenesis. In this thesis the tumour suppressor protein Fhit was identified as a novel direct interaction partner of Pontin and Reptin. The binding site of Fhit in Pontin and Reptin was mapped to amino acids 67-148 and 1-147, respectively. These sequences are not bound by any known interaction partner like beta-Catenin, Hint1 or c-Myc. Pontin or Reptin and Fhit affect b-catenin/LEF-1/TCF4-mediated- reporter gene activity. Pontin reduced the repressive effects of Fhit, whereas Reptin potentiated them. Imaging with confocal-immunofluorescence microscopy revealed a co-localisation of Pontin or Reptin and Fhit in the nucleus of different cell lines. ChIP and Re-ChIP experiments revealed common complexes of Fhit and Pontin, Reptin or beta-Catenin bound to promoter elements of the known Wnt target genes Cyclin D1 and MMP-14. Since these findings pointed to an involvement of Fhit in chromatin-remodelling processes, co-immunprecipitation experiments were performed showing that Fhit, Pontin and Reptin form a complex with the histone-acetyltransferase Tip60. In pull-down experiments with recombinant proteins a direct interaction between Fhit and Tip60 was detected. These discoveries suggest a new function of Fhit in chromatin-remodelling complexes. Using monoclonal antibodies developed in our laboratory, Pontin was detected in dot like structures in the nucleolus in immunfluorescence microscopy. More detailed investigations revealed that Pontin accumulates in a cell-cycle dependent manner in the nucleolus, where it forms complexes with RNA-Polymerase I in the fibrillar centers and binds to regulatory elements in the chromosomal DNA of rRNA-gene clusters in combination with c-Myc. Since nucleoli with strong Pontin staining showed a clear reduction of newly synthesized RNA it is reasonable to assume that Pontin is a positive regulator of rRNA transcription and that sequestration of Pontin to transcriptionally inactive fibrillar centers might represent a regulatory mechanism of rRNA transcription during the cell cycle.