Hypothermie zur Organprotektion

Abstract

Zur Protektion unreifer Organsysteme während herzchirurgischer Eingriffe unter Herzkreislaufstillstand wird die Körpertemperatur der Patienten durch systemische Kühlung auf minimal 16°C reduziert. Hypothermie reduziert den Gewebestoffwechsel und erhöht dadurch möglicherweise den Zellschutz während Phasen der Minderperfusion der Gewebe. Trotzdem wird vermutet, dass neurologische Komplikationen und psychomotorische Entwicklungsstörungen, Kapillarleck-Syndrom und prolongierte Inflammation gehäuft nach tief hypothermem Herzkreislaufstillstand auftreten 70, 71. Die Pathophysiologie dieser Komplikationen sowie der molekularbiologische Mechanismus der tiefen Hypothermie in diesem klinischen Kontext sind bisher nahezu ungeklärt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeiten wurden deshalb folgende Aspekte der therapeutischen Hypothermiebehandlung in Zellkulturmodellen adressiert: 1\. Neuroprotektion – Neuroregeneration durch Hypothermie und Analyse der Hypothermie-induzierten morphologischen, funktionellen und immunhistochemischen Veränderungen auf Neurone, Mikrogliazellen, Astrozyten sowie axonales Auswachsen in Hirnschnittkulturen. 2\. Untersuchungen zu den Auswirkungen der Hypothermie auf die Funktionalität und die Morphologie der Endothelzellbarriere, auf das Inflammationsverhalten von Endothelzellen sowie Interventionsmöglichkeiten mit Methylprednisolon und Tacrolimus. 3\. Analyse des Einflusses der Hypothermie und Applikation von Kardioplegielösung auf Kardiomyozyten während oxidativem Stress. Hypothermie hat auf neuronale Zellen und die umgebenden immunmodulatorischen Gliazellen eine protektive Wirkung. Dies konnte in der Einzelzellkultur primärer Neurone, Mikrogliazellen und Astrozyten gezeigt werden. Darüber hinaus führte die Hypothermie in aktivierten Mikrogliazellen zu einer Verschiebung des Zytokingleichgewichtes in Richtung anti-inflammatorische Zytokine bei reduzierter Produktion pro- inflammatorischer Zytokine und gesteigerter Expression anti-inflammatorischer Proteine. Weiterhin kam es 72h nach der Wiedererwärmung zu einer verminderten Zellproliferation. Unstimulierte Mikrogliazellen zeigten direkt nach der Wiedererwärmung eine gesteigerte Aktivität und Phagozytose. In organotypischen Hirnschnittkulturen induzierte eine zweistündige Kühlung bei 17°C ein signifikant verstärktes axonales Auswachsen. Diese Ergebnisse belegen, dass Hypothermie nicht nur Schutzeffekte im Zentralen Nervensystem ausübt, sondern zusätzlich das axonale Auswachsen über die TNF-- Regulierung als einen möglichen Mechanismus der Regeneration unterstützt. In Untersuchungen an humanen Endothelzellen konnten wir feststellen, dass als Zellprotektionsmechanismus unter Dauerkühlung das antiapoptotische Protein Bcl-2 verstärkt gebildet wird. Gekühlte Endothelzellen sind nicht in der Lage, ihre grundlegenden Funktionen wie Proliferation und Zellaktivierung aufrechtzuerhalten. Andererseits sahen wir als positiven Effekt unter Dauerkühlung eine generalisiert verminderte Inflammation. Des Weiteren zeigten auch unstimulierte Endothelzellen nach Kühlung und Wiedererwärmung starke Veränderungen in der Zellmorphologie unter Kühlungsbedingungen. Hypothermie induziert eine endotheliale Dysfunktion bestehend aus gesteigerter Permeabilität und verminderter Adhäsion der Zellen. Intrazellulär wurden die morphologischen Veränderungen während Hypothermie und Wiedererwärmung über eine ERK 1/2-Aktivierung und über Connexin 43-Degradation in der Kühlungsphase gesteuert. Die morphologischen Veränderungen während der Kühlungsphase korrelieren mit dem klinischen Bild des Kapillarleck-Syndroms, welches vor allem nach langen Operationszeiten unter tiefen Kühlungsbedingungen gesehen wird. Interessanterweise führte die Wiedererwärmung der Endothelzellen zu einem Verschluss der Lücken. Beim Erreichen von 37°C bestand erneut eine geschlossene Endothelzellbarriere. Darüber hinaus kam es nach der Wiedererwärmung der Endothelzellen zu gesteigerter IL-6-Sekretion. Als klinisch relevante Ergebnisse dieser Studie konnten wir zeigen, dass nur die kombinierte Therapie aus Methylprednisolon und Tacrolimus die Hypothermie- induzierte endotheliale Dysfunktion und IL-6-Ausschüttung reduzierte. Dies könnte ein sehr interessanter neuer Therapieansatz zur Verhinderung des postoperativen Kapillarleck-Syndroms und der prolongierten Inflammation nach Hypothermie sein. In den Arbeiten an Kardiomyozyten konnten wir belegen, dass Hypothermie Kardiomyozyten während oxidativen Stresses vor Apoptose, DNA - Schaden und mitochondrialer Dysfunktion schützt. Hypothermie reduzierte signifikant die Ausschüttung der Laktatdehydrogenase, die Spaltung von Caspase 3 und 9. Ferner konnten weniger M30-CytoDEATH-positive Zellen nach Hypothermie und Wiedererwärmung in den geschädigten Kardiomyozyten gesehen werden. Nach dem Wiedererwärmen der H2O2 geschädigten Kardiomyozyten kam es zu signifikant niedrigeren intrazellulären ROS Konzentrationen bei gesteigerter mitochondrialer Dehydrogenaseaktivität und höherem intrazellulären ATP-Gehalt. Weitere Mechanismen, die zu einer erhöhten Überlebensrate der hypothermen Kardiomyozyten führte, war die Hochregulation des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 und die Verminderung der Phosphorylierung von p53. DNA-Schaden, der durch die PARP-1-Spaltung und die H2AX-Phosphorylation nachgewiesen werden kann, wurde durch die Hypothermie deutlich reduziert.

Hypothermia is the oldest method for organprotection during pediatric cardiac surgery. During deep hypothermic cardiac arrest (DHCA) the body temperature of patients is reduced to 16°C. Hereby hypothermia reduces cell metabolism leading to cell protection during periods of reduced perfusion of the tissues. Nevertheless, it is assumed that neurological complications and psychomotor developmental disorders as well as capillary leak syndrome more frequently occur after DHCA. The underlying pathophysiology of these complications as well as the molecular mechanism induced by deep hypothermia in this clinical context is up to know not fully understood. In the present work, therefore the following aspects of therapeutic hypothermia have been addressed in different cell culture models: 1.) Neuroprotection – neuroregeneration: Analysis of hypothermia-induced morphological, immunohistochemical and functional changes in neurons, microglia cells, astrocytes as well as axonal outgrowth in brain slice cultures. 2.) Effects of hypothermia on function, morphology and inflammatory reaction of the endothelium as well as opportunities for intervention with methylprednisolone and tacrolimus. 3.) Analysis of the influence of hypothermia and administration of cardioplegic solution on cardiomyocytes during oxidative stress. Hypothermia exerts protection on neurons and surrounding immunomodulatory glial. This was demonstrated in single cell culture of primary neurons, microglia cells and astrocytes. In addition, hypothermia resulted activation of microglia cells with a shift towards higher anti-inflammatory cytokines because of a reduced production of proinflammatory cytokines and increased expression of anti-inflammatory proteins. Unstimulated microglial cells showed directly after rewarming increased cell activity and phagocytosis. In organotypic brain slice cultures hypothermic treatmed led to significantly increased axonal outgrowth. These results indicate that hypothermia exerts not only protective effects but could also led to neuroregeneration possibly via an up-regulation of TNF-alpha. In experiments with human endothelial cells, we found one possible cell protective mechanism under continuous cooling was the up-regualtion of the anti-apoptotic protein Bcl-2. Continously cooled endothelial cells are not able to maintain their basic functions such as proliferation and cell activation. On the other hand, we saw a beneficial effect under continuous cooling, a generalized decrease inflammation. Furthermore, there were strong changes in cell morphology under cooling conditions. Hypothermia induced endothelial dysfunction consisting of increased permeability and reduced adhesion of the cells. This was in line with ERK 1/2 activation and connexin 43 degradation during cooling and rewaming phase. The morphological changes during the cooling phase correlated with the clinical picture of the capillary leak syndrome, which is seen especially after long operating times under DHCA. Interestingly, the rewarming of the endothelial cells led to a closure of the gaps. Upon reaching 37 ° C the endothelial barrier was closed again. Moreover, two hours after rewaming there was an significantly increased IL-6 secretion. As a clinically relevant results of this study, we demonstrated that only the combined therapy of methylprednisolone and tacrolimus reduced the hypothermia induced endothelial dysfunction and IL-6 secretion. This could be a very interesting new therapeutic approach for the prevention of postoperative capillary leak syndrome and inflammation after prolonged hypothermia. In the study on cardiomyocytes we could demonstrate that hypothermia during oxidative stress reduced apoptosis, mitochondrial dysfunction and DNS damage. Hypothermia significantly reduced the release of lactate dehydrogenase and the cleavage of caspase 3 and 9. Furthermore, less CytoDeath M30-positive cells were seen after hypothermia and rewarming in the damaged cardiomyocytes. After rewarming the H2O2-damaged cardiomyocytes significantly lower intracellular ROS levels with increased mitochondrial dehydrogenase activity and a higher intracellular ATP content were seen. Other mechanisms which led to an increased survival rate of the hypothermic cardiomyocytes, was the upregulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and the reduction in the phosphorylation of p53. DNA damage that can be detected by PARP-1 cleavage and-H2AX phosphorylation was significantly reduced by hypothermia.