dc.contributor.author
Khlaf, Mohammed Rawway Khalil
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:57:26Z
dc.date.available
2011-08-19T10:29:15.403Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3211
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7411
dc.description.abstract
This thesis describes experiments to evolve a mesophilic bacterium,
Escherichia coli, towards halophily. The applied technology consisted in the
continuous proliferation of vast populations of cells in suspension in the
"Genemat" format under self-adjusting, limiting NaCl concentrations in the
growth medium. This was achieved by applying a conditional pulse feed regime
where the proliferating suspension culture is periodically diluted with a
"permissive" medium of an osmolarity that is compatible with growth of the
cells if cell density falls below a pre-set value, and with a pulse of
"nonpermissive" medium of high osmolarity when cell density is superior to
this threshold. This regime favors genetic variants with elevated
osmotolerance, which rapidly replace their less-adapted progenitors. Two
parallel cultures were run over approximately 8800 and 6700 generations,
respectively. The first culture consisted of the prototypic E. coli strain
MG1655, the second of a Δdef/fmt/mutD variant (ε2124) which is distinct from
other eubacteria in its mechanism of initiation of translation and, in
addition, shows a mutator phenotype. Both experiments yielded offspring with
greatly enhanced levels of halotolerance, MG1655 evolvants growing at steady
state concentrations of 1.3 M NaCl with generation times of about 4 hours,
ε2124 evolvants supporting steady state concentrations of about 1.2 M NaCl.
The former can grow in salinities of up to 2.0 M, the latter up to 1.6 M. They
tolerate similar concentrations of KCl and K2SO4, as well as the uncharged,
osmotically active sugar, sorbitol. Evolved derivatives are impaired in growth
at low salinities but can still be adapted to grow in the absence of
extracellular salt. Whereas adaptation proceeded smoothly for MG1655 cells,
the ε2124 culture showed massive and sustained oscillations in the consumption
of nonpermissive medium, an effect that could be due to its high genetic
variability. Whereas both populations of evolving cells relied on synthesis of
the disaccharide trehalose as an intracellular osmoprotectant during the
initial stages of the experiments, both cultures switched later this strategy
to massive accumulation of the amino acid proline which can accumulated to
intracellular concentrations of up to 500 mM during growth in high salt
medium. Both derivatives may chronically enrich K+ ions in their cytosol since
both showed enhanced sensitivity for the presence of KI, and MG1655
derivatives could not grow at salt concentrations of more than 1 M NaCl when
K+ was omitted from the growth medium. The general stress response of evolved
cells was compared with that of wild type MG1655 cells by analyzing the
expression of the stress sigma factor, RpoS, on Western Blots of cellular
proteins isolated during growth at various salt concentrations. From these
analyses it can be concluded that the stress answer sets in at higher
salinities in the evolved derivatives. Changes in the outer membrane and total
proteomes were revealed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and two-
dimensional gel electrophoresis. Further work should aim in doing analysis of
the adaptive changes during the evolution process in molecular details by
determination of the complete genome sequences as well as further functional,
physiological, transcriptomic, and proteomic analysis, and both experiments
should be continued.
de
dc.description.abstract
Diese Arbeit beschreibt Experimente zur Evolution des mesophilen Bakteriums
Escherichia coli zur Halophilie. Dazu wurde die Technologie der
kontinuierlichen Kultur großer Populationen von Zellen in Suspension unter
automatisch eingestellten, gerade noch mit dem Wachstum der bestangepassten
Varianten vereinbaren Salzkonzentrationen im "Genemat"-Format angewendet. Die
Zellen wurden in einem conditional pulse feed Regime kultiviert. Dabei wird
das Kulturgefäß mit Pulsen eines "permissiven" Mediums (mit einer
Salzkonzentration, die mit dem Wachstum der Zellen vereinbar ist) verdünnt,
wenn die Zelldichte unter einer vorgegebenen Schwelle liegt. Übersteigt die
Zelldichte diese Schwelle, so wird stattdessen mit einem Puls von
"nichtpermissivem" Medium (mit wachstumslimitierender Salzkonzentration)
verdünnt. Unter diesen Bedingungen genießen genetische Varianten mit erhöhter
Salztoleranz einen selektiven Vorteil gegenüber ihren weniger salztoleranten
Vorläufern und verdrängen diese rasch aus der Kultur. Es wurden zwei parallele
Experimente über etwa 8800 Generationen und etwa 6700 Generationen
durchgeführt. Für das erste Experiment wurde der prototypische E. coli Stamm
MG1655 eingesetzt, für das zweite ein Abkömmling davon, ε2124, der sich durch
eine Deletion des def/fmt Operons auszeichnet und sich daher im Mechanismus
der Initiation der Proteinsynthese von anderen Eubakterien unterscheidet und
der zudem auf Grund einer Mutation des mutD Gens einen Mutatorphänotyp zeigt.
Beide Experimente resultierten in der Selektion von Evolvaten, die gegenüber
dem Ausgangstyp stark erhöhte Salzresistenz aufweisen, wobei MG1655 Derivate
mit Generationszeiten von etwa 4 Stunden kontinuierlich bei 1,3 M NaCl wachsen
können, ε2124 Derivate bei etwa 1,2 M NaCl. MG1655 Derivate zeigen Wachstum
noch bei 2 M NaCl, ε2124 Derivate bis etwa 1,6 M. Ähnliche Konzentrationen
anderer Salze wie KCl und K2SO4 werden ebenso toleriert wie hohe
Konzentrationen des Zuckers Sorbitol. Die evolvierten Derivate wachsen
schlecht in Abwesenheit von Salz, können aber noch an Medien mit geringen
Salzkonzentrationen adaptieren. Während die Adaptation im Fall von MG1655
recht gleichmäßig voranschritt, zeigte die ε2124 Kultur starke, anhaltende
Schwankungen im Verbrauch an nichtpermissivem Medium. Dies könnte im Mutator-
Phänotyp dieser Linie begründet sein. Während früher Stadien der
Evolutionsexperimente akkumulierten Zellen beider Linien intrazellulär das
Disaccharid Trehalose als osmoprotektive Substanz. Beide Linien wechselten
dann auf die massive intrazelluläre Akkumulation der osmoprotektiven
Aminosäure Prolin, die in den Zellen bei hoher externer Salinität
Konzentrationen von bis zu 500 mM erreichen konnte. Eine erhöhte Sensitivität
gegenüber dem toxischen KI und eine starke Verringerung der Salztoleranz in
Abwesenheit von Kalium im Medium könnten darauf hinweisen, dass die
evolvierten Derivate intrazellulär Kaliumionen anreichern. Die Stressantwort
evolvierter Zellen wurde mit der von Wildtyp Zellen anhand der Expression des
"Stress-Sigmafaktors" RpoS während des Wachstums in unterschiedlichen
Salinitäten verglichen. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen
werden, dass die Stressantwort in den evolvierten Stämmen bei höherer externer
Salzkonzentration induziert wird als im Wildtyp. Analysen der
Proteinzusammensetzung von Präparationen der äußeren Membran und von Gesamt-
Zellextrakten durch 1- und 2-dimensionale Gelektrophoresen zeigen Änderungen
im Proteom. Neben der Fortsetzung der Evolutionsexperimente sollten in
künftigen Arbeiten molekulare Details des Adaptationsprozesses anhand von
Gesamtsequenzen der evolvierten Genome ermittelt werden, und weitere
funktionelle und physiologische Studien sowie Transkriptom- und
Proteomanalysen sollten durchgeführt werden, um Ablauf und Resultat der
Evolution zu beschreiben.
de
dc.format.extent
X, 94 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Escherichia coli
dc.subject
Experimental evolution
dc.subject
Evolution of halotolerance
dc.subject
Halotolerance and halophily
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Experimental evolution of halotolerance in Escherichia coli
dc.contributor.contact
mkhlaf@zedat.fu-berlin.de; m_rawway@yahoo.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Kürsad Turgay
dc.date.accepted
2011-08-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000023818-2
dc.title.translated
Experimentelle Evolution von Halotoleranz in Escherichia coli
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000023818
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000009732
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access