Effekte von C3bot und C3bot-Peptiden auf synaptische Konnektivität und neuronale Regeneration

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von C3bot und daraus abgeleiteten Peptiden – C3bot156-181 (26 Aminosäuren) und C3bot163-177 (15 Aminosäuren) sowie dem schon bekannten C3bot154-182 (29 Aminosäuren) – in verschiedenen neuronalen Gewebemodellen untersucht. Anhand der immunfluoreszenzbasierten Auszählung synaptischer Kontakte an den Dendriten primärer Hippocampusneurone von Mäuseembryonen wurde gezeigt, dass C3bot und C3bot156-181 in der Lage sind, die Zahl von Synapsen zu erhöhen. Dies konnte auch an VGLUT1/2-markierten und etwas schwächer an VGAT-markierten Kontakten nachgewiesen werden. C3bot163-177 erwies sich in dieser Anwendung als unwirksam. Bei Wachstum der Neurone auf Chondroitinsulfatproteoglykan als inhibitorischem Substrat wurde die Kontaktzahl gesenkt. Diese Verminderung konnte durch die Anwendung von C3bot, C3bot156-181 und dem schon als wirksam veröffentlichten Peptid C3bot154-182 aufgehoben werden. Die Zahl der Synapsen stieg ebenfalls durch den knock-down von RhoA mittels siRNA RhoA G28. Eine weitere Steigerung der Zahl war bei kombiniertem knock-down mit C3-Substanzen nicht möglich. In der proteinbiochemischen Analyse der Hippocampuskulturen zeigte sich im Wesentlichen, dass bei Anwendung von C3bot156-181 eine gesteigerte Expression von Synaptophysin und SNAP 25 erfolgt. Andere prä- und postsynaptische Proteine blieben unbeeinflusst. Anhand organotypischer Hirnschnittkulturen des enthorhinalen Kortex von Mäusen wurde gezeigt, dass C3bot156-181 die Zahl und die Länge auswachsender Axone erhöht. C3bot163-177 hatte dabei keinen Effekt. C3bot und C3bot156-181 in Kombination bewirken noch eine weitere leichte Steigerung dieser Zahlen. In einem Pulldown-Assay zur Bestimmung der RhoA-Aktivität im durch Hemisektion geschädigten Rückenmark von Mäusen konnte bestätigt werden, dass die Verletzung zu einem erhöhten Niveau von aktiviertem RhoA führt. C3bot156-181, C3bot154-182 und C3bot163-177 waren in der Lage, diese Aktivierung nach sieben Tagen zu verringern. Der Arbeit hinzugefügt wurden Daten zur Bewegungsfähigkeit von Mäusen nach Hemisektion und Druckläsion des thorakalen Rückenmarks. Diese wurden einer Behandlung mit C3bot156-181 unterzogen, worauf sich eine verbesserte motorische Regeneration zeigte. Zusammenfassend zeigt sich, dass die enzymatisch-inaktiven Peptide ihre Wirkung über die Verringerung der Aktivität von RhoA ausüben. Für die neurotrophen Eigenschaften werden aufgrund der geringen Konzentration bei den Anwendungen ein Rezeptor-abhängiger Mechanismus oder gezielte Internalisierungsprozesse postuliert. Versuche der Aufklärung dessen sind in Vorbereitung. Aufgrund ihres positiven Effektes auf die Neuroregeneration und ihrer Vorteile gegenüber C3bot selbst sind die C3-Peptide in der therapeutischen Anwendung vorstellbar.

In this work C3bot and peptides derived from thisADP-ribosylating C3 transferase named C3bot156-181 (26 amino acids),C3bot163-177 (15 amino acids) and before known C3bot154-182 (29 amino acids)were investigated concerning their effects in different neuronal tissue models. Using immunofluorescence- based counting of synaptic contactsdetected via antibody-staining of primary hippocampal neurons an increase ofthe number of dendritic synapses due to the application of C3bot andC3bot156-181 could be discovered. This could also be shown by counting contactsstained by using antibodies against VGLUT1/2 and VGAT. The application ofC3bot163-177 did not have any effect. When growing neurons on the inhibitorychondroitinesulfate proteoglycans the number of synaptic contacts wasdecreased. This reduction could be neutralized by C3bot, C3bot156-181 and thebefore published potent peptide C3bot154-182. A knock-down of RhoA using thesiRNA RhoA G28 could also raise the number of synaptic contacts. Combination ofthe siRNA and C3-derivates did not lead to an additional effect. Analysis of the expression levels of synaptic proteins inhippocampal cell culture after treatment with C3bot156-181 could show anincrease of the amount of synaptophysin and SNAP 25. There was no effect onother pre- und postsynaptic proteins. With organotypical brain slices it is possible to measurethe length and number of growing axons. C3bot156-181 was able to influence bothparameters positively with C3bot163-177 having no effect. Combination of C3botund C3bot156-181 slightly increased the positive effect. It could be confirmed that the level of activated RhoA ishigher in injured murine spinal cord. Therefore a pulldown-assay for thedetection of RhoA-activity was performed and used to detect a possible impactof the C3-peptides on this level. C3bot156-181, C3bot154-182 as well asC3bot163-177 could reduce the activity of RhoA after seven days. Data on the locomotion of mice after thoracic spinal cordlesion (hemisection or compression) was added to the work. C3bot156-181improved the locomotor recovery. The enzyme-deficient peptides perform their effects viareduction of RhoA-activity. Because of the minimal concentration of thesubstances during their application a receptor- dependent mechanism or specificinternalization of the petides can be assumed. Experiments confirming thisspeculation are in preparation. Seeing the positive effects of the C3-Peptides onneuroregeneration and their adavantages over C3bot they appear as potenttherapeutic agents.