Interaction, Function and Regulation of the Tight Junction Protein Tricellulin

Abstract

The paracellular barrier characteristics of epi- and endothelial layers relay on the properties of tight junctions (TJs). Based on the localization, morphology and protein composition, TJs can be classified into areas where two (bicellular TJs) or three cells (tricellular TJs) join together. Tricellulin (Tric) specifically localizes and tightens tricellular TJs while claudins (Clds), occludin (Occl) and marvelD3 (MD3) localize at bicellular TJs. Clds form the backbone of bicellular TJs. TJ-associated MARVEL proteins (TAMPs; Occl, MD3 and also Tric) are assumed to be of regulatory relevance of TJs. Interplay of Clds and TAMPs in the assembly of a functional barrier and in pathological alterations of these interactions have not yet been analyzed. The cumulative thesis consists of four publications, aiming to understand how TJ proteins are regulated, interact with each other and maintain/ affect functions of tissue barriers. (Ms1) The results led to the generation of a model for heterophilic TJ-strand formation: two to six Cld molecules form oligomers within intracellular membranes. The strength of cis-interactions along the cell membrane is Cld subtype specific. The cis-oligomers reach the plasma membrane and diffuse to the TJs. Then, trans-interactions between Clds of opposing cells enable the formation of TJ-strands. With this study we established two novel methods to measure FRET in intracellular compartments (FRET-FACS) and to determine paracellular permeability by an image-based technique. (Ms2) We identified the cytosolic C-terminal tail in Tric being essential for the transport to the plasma membrane and the enrichment at its tricellular TJs (N-terminal tail). (Ms3) Within the TAMPs, MD3 interacts with Occl and Tric at bicellular contacts, whereas Tric and Occl interact during the transport to the plasma membrane only. We demonstrate, for the first time heterophilic interactions between TAMPs and Clds. The interactions are essential for a physiological TJ-strand network, reflected by the immobilization of Tric and Occl at the plasma membrane by Cld1 and by an improvement of the Cld1-formed TJ-strand network by Occl, Tric or MD3. These findings show a novel regulatory function of TAMPs at TJs. (Ms4) We demonstrated, in vitro and in vivo, that Tric and Occl are primary targets in pathologies linked to alterations in the redox state. We showed that the ECL2 in Tric and Occl is redox-sensitive and redox changes cause alterations in their structure, function and localization. Therefore, Occl and Tric are redox-regulators of TJs; Tric acts as superordinate TJ regulator not only at the tri- but also at bicellular TJs. Alterations in the Tric-ECL2 structure alter the localization of Tric and also of other TJ proteins such as Cld1, MD3 and ZO-1. Tric-mediated alterations in the TJ-strand network led to a breakdown of the epithelial barrier properties. In summary, the findings offer novel perspectives for potential diagnosis and treatment of diseases associated with alteration in redox-state, like inflammation, stroke or cancer. The studies provided substantial contribution for better analysis and understanding of structure and function of TJ proteins under normal and pathological conditions.

Die parazellulären Barriereeigenschaften von Epi- und Endothelien werden hauptsächlich von Tight Junctions (TJs) bestimmt. Hinsichtlich Lokalisation, Morphologie und Proteinzusammensetzung lassen sich TJs in Zell-Zell Kontakte zwischen zwei Zellen (bizelluläre TJs) bzw. drei Zellen (trizelluläre TJs) einteilen. Trizellulin (Tric) dichtet spezifisch trizelluläre TJs ab; der Mechanismus ist unbekannt. Claudin (Cld), Occludin (Occl) und MarvelD3 (MD3) lokalisieren an bizellulären TJs. Cld tragen die Hauptabdichtungsfunktion der bizellulären TJs. Für TJ-assoziierte MARVEL Proteine (TAMPs; Occl, Tric, MD3) wird eine regulierende Funktion angenommen wird. Neben dem trizellulären Abdichtungsmechanismus sollen mögliche Wechselwirkungen zwischen TAMPs und Claudinen herausgefunden werden, die die Bildung und Aufrechterhaltung des TJ Netzwerkes beeinflussen. Gefundene Interaktionen zwischen TJ-Proteinen und Tric sollen unter pathologischen Bedingungen charakterisiert werden. Der kumulativen Arbeit liegen vier eigene Publikationen zugrunde. (Ms1) Aus den Cld-Interaktionsstudien wurde ein Modell abgeleitet, das die Bildung von heterophilen TJ-Strängen erklärt: zwei bis sechs Cld-Moleküle oligomerisieren in cis entlang intrazellulärer Membranen. Die Stärke der cis-Interaktionen ist Cld subtypspezifisch. Die Cld cis-Oligomere werden zur Plasmamembran transportiert, wo sie zu den TJs diffundieren. Hier werden die Oligomere durch zusätzliche trans-Interaktionen zwischen benachbarten Zellen an den TJs immobilisiert. Für die Arbeit wurde ein neues Verfahren zur parazellulären Permeationsmessung entwickelt sowie eine Methode entwickelt, um mit FACS Lebendzell-FRET Messungen durchführen zu können. (Ms2) Weiterhin wurde die Bedeutung der zytoplasmatischen Domänen von Tric aufgeklärt. Dabei ist die C-terminale zytosolische Domäne an der Membranlokalisation beteiligt; die N-terminale zytosolische Domäne ist essentiell für die Lokalisation in trizellulären TJs. (Ms3) Bei den Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen TAMPs sowie zwischen Claudinen und TAMPs wurde gezeigt, dass TAMPs homo- und heterophil interagieren, abgesehen von Tric und Occl Assoziationen. Occl, Tric und MD3 zeigten starke Bindungen zu Cld1 und schwächere zu anderen Claudinen. Weiterhin wurde eine regulatorische Rolle der TAMPs nachgewiesen, wobei Occl, Tric und MD3 die von Cld1 gebildeten TJ-Netzwerke engmaschiger gestalteten. (Ms4) In vitro und in vivo fanden wir, dass Tric und Occl spezifische Redoxregulatoren sind. Wir konnten zeigen, dass strukturelle Veränderungen im Tric-ECL2 die Lokalisation von Tric ändert, mit Auswirkungen auf andere TJ Proteine wie Cld1, MD3 und ZO-1. Die durch Tric vermittelten Veränderungen im TJ Netzwerk bewirken einen Zusammenbruch epithelialer Barrieren. Daher muss Tric als übergeordneter Redox-Regulator der TJs angesehen werden. Insgesamt sind die gewonnenen Erkenntnisse von Relevanz für künftige Untersuchungen zur Diagnostik und Therapie von Erkrankungen die mit Veränderungen des Redoxpotentials einhergehen, wie z.B. Entzündungen, Schlaganfall oder Tumoren. Damit liefert die Arbeit einen substantiellen Beitrag zum besseren Verständnis von strukturellen und funktionellen Eigenschaften von TJ Proteinen unter normalen und pathologischen Bedingungen.