Untersuchungen zur Veränderung der Reaktionsspezifität der 15-Lipoxygenase (ALOX15) im Rahmen der späten Säugetierevolution und zur Wirkung von Hemmstoffen auf die ALOX15-Orthologen verschiedener Säugetiere

Abstract

Einleitung: Die 15-Lipoxygenase (ALOX15) ist eine Nichthämeisen enthaltende Dioxygenase, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu Hydroperoxyfettsäuren oxygeniert. Sie ist an der Synthese von bioaktiven Botenstoffen (Leukotriene, Lipoxine) sowie am Lipoproteinstoffwechsel beteiligt und spielt damit eine wichtige Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. ALOX15-Orthologe werden von fast allen Säugetierspezies exprimiert. Phylogenetisch ältere Säugetiere (Maus, Ratte, Schwein) besitzen 12-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während höher entwickelte Säugetiere (Schimpansen, Mensch) 15-lipoxygenierende Enzyme exprimieren. Um mögliche Triebkräfte für diese evolutionäre Veränderung der Reaktionsspezifität von ALOX15-Orthologen zu identifizieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit vier Arbeitshypothesen getestet: i) 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe besitzen eine höhere Linolsäureoxygenierungsaktivität und sind damit effektivere Enzyme. ii) 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe verfügen über eine höhere Membranoxygenaseaktivität. iii) 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe weisen eine höhere Syntheseaktivität für antiinflammatorische Lipoxine auf. iv) Die Sensitivität gegenüber LOX-Hemmstoffen korreliert mit der Reaktionsspezifität der ALOX15-Orthologen. Methodik: Um diese Hypothesen zu testen, wurden ALOX15-Orthologe verschiedener Säugetiere rekombinant exprimiert und deren Fähigkeit zur Linolsäureoxygenierung, zur Membranoxygenierung und zur Lipoxinsynthese miteinander verglichen. Weiterhin wurde die Hemmbarkeit der Enzymorthologen durch ausgewählte Lipoxygenasehemmstoffe getestet. Ergebnisse: Es konnten keine systematischen Unterschiede zwischen 12- und 15-lipoxygenierenden ALOX15-Orthologen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Oxygenierung von Linolsäure und von Biomembranen nachgewiesen werden. Unter Verwendung verschiedener Substrate wurde gezeigt, dass die Lipoxinsynthaseaktivitäten von 15-lipoxygenierenden ALOX15-Orthologen signifikant (p<0.01) höher lagen als die von 12-lipoxygenierenden Enzymen. Die Hemmwirkung ausgewählter Standardhemmstoffe korrelierte nicht mit der Reaktionsspezifität der Arachidonsäureoxygenierung. Schlussfolgerung: 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe haben eine höhere Synthaseaktivität für antiinflammatorische Lipoxine als 12-lipoxygenierenden Enzyme. Diese Daten können dahingehend interpretiert werden, dass höher entwickelte Säugetiere die Entzündungsreaktion besser kontrollieren können. Die veränderte Reaktionsspezifität der ALOX15 wäre damit Bestandteil einer evolutionären Optimierungsstrategie des Immunsystems. Da die Effektivität der Hemmung von ALOX15 durch Standardhemmstoffe nicht mit der Reaktionsspezifität korreliert und da sich ALOX15-Orthologe hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber verschiedenen Hemmstoffen teils drastisch voneinander unterscheiden, kann a priori nicht davon ausgegangen werden, dass effektive Hemmstoffe der humanen ALOX15 (15-lipoxygenierend) auch die murinen ALOX15-Orthologen (12-lipoxygenierend) hemmen.

Introduction: 15-lipoxygenase (ALOX15) is a nonheme-iron containing dioxygenase that catalyzes the dioxygenation of polyunsaturated fatty acids to hydroperoxy derivatives. It has been implicated in the biosynthesis of lipid mediators such as leukotriens and lipoxins but also in lipoprotein metabolism and thus, it plays an important role in physiological and pathophysiological processes. ALOX15 genes occur in most mammalian genomes and the ALOX15-orthologs of lower mammals (mouse, rat, pig) exhibit arachidonic acid 12-lipoxygenating activities. In contrast, higher mammals (human, chimpanzee) express arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. To explore the potential driving forces for these evolutionary alterations the following hypothesises were tested in this dissertation: i) 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs exhibit a higher linoleic acid oxygenase activity than 12-lipoxygenating orthologs and thus, are more effective lipid peroxidizing enzymes. ii) 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs exhibit a higher membrane oxygenase activity. iii) 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs exhibit a higher biosynthetic capacity for anti-inflammatory lipoxins. iv) The sensitivity of ALOX15-orthologs for standard LOX-inhibitors correlates with the reaction specificity of the enzymes. Methodology: To test these working hypothesises we expressed several 12- and 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs as recombinant proteins in E. coli and quantified their oxygenase activities of linoleic acid and biomembranes. We also measured their synthetic capacity for anti- inflammatory lipoxins and tested their sensitivity for standard LOX inhibitors. Results: We did not detect significant differences between 12- and 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs when we quantified the linoleic acid and membrane oxygenase activity of the enzymes. In contrast, the biosynthetic capacity for anti-inflammatory lipoxins from different substrates was significantly (p<0.01) higher for 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs when compared with their 12-lipoxygenating counterparts. The inhibitory potency of several standard LOX-inhibitors did not correlate with the reaction specificity of the ALOX15-orthologs. Conclusions: When compared with 12-lipoxygenating ALOX15-orthologs 15-lipoxygenating enzymes exhibit an improved capacity for the biosynthesis of anti-inflammatory lipoxins. From this data it might be concluded that higher mammals, which express 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs, have an improved capacity for controlling inflammatory reactions. If this is the case the observed evolutionary switch in the reaction specificity of ALOX15-orthologs can be considered as part of a more comprehensive evolutionary program aimed at optimizing the mammalian immune system. Since the inhibitory potency of various standard LOX-inhibitors did not correlate with the reaction specificity and since the degree of inhibition was different for ALOX15-orthologs of different species one cannot conclude that effective inhibitors of human ALOX15 do also inhibit murine or porcine ALOX15-orthologs.