Kombination von Chemotherapie und MDM2-Inhibition als neuer therapeutischer Ansatz beim Neuroblastom: MDM2-Inhibitor basierte Kombinationstherapien zur Prävention von Resistenzen

Abstract

The treatment of high-risk neuroblastoma is currently one of the most important challenges in pediatric oncology. Despite aggressive multimodal treatment, the 5-year survival rate of patients with high-risk neuroblastoma is approximately 50%, and recurrence or progression of the tumor disease is often fatal. Thus, the development of new, targeted therapeutic approaches is one of the most important goals of pediatric oncological research. Targeted activation of the tumor suppressor p53 by inhibition of the p53 negative regulator MDM2 has been extensively studied in neuroblastoma. In order to prevent the development of de novo mutations it is of great interest to investigate effective combination therapies to achieve more durable treatment responses. We investigated the effect of the MDM2 inhibitor DS3032b in combination with chemotherapy and the combination of the MDM2 inhibitor RG7388 with the Survivin inhibitor YM155. Survivin overexpression is associated with poor prognosis, metastasis, and chemotherapy resistance, making it an attractive target for novel therapeutic approaches. This work aims to provide basic, preclinical data as a basis for potential clinical use of MDM2 inhibitor-based combination therapy. Methods/Materials The effects of the combination treatment on cell viability, migration and apoptosis was investigated in vitro using established neuroblastoma cell lines with varying genetic backgrounds. The effects of the combination treatment on neuroblastoma cell viability was investigated using XTT and CI values were calculated, using CompuSyn software. Scratch Assays were performed to investigate the effects of the combination treatment on migration. Apoptosis induction was detected by flow cytometry using Annexin/PI, Caspase-3 antibody and by immunoblot based detection of PARP cleavage. TP53 dependency was tested using neuroblastoma cell lines overexpressing a dominant negative TP53 mutant. Mode-of-action analysis was performed using western blotting experiments. Results We investigated the effect of the MDM2 inhibitor DS3032b with conventional chemotherapy and demonstrated synergistic enhancement of viability inhibition. We characterized the effects of the clinically more advanced MDM2 inhibitor RG7388 in combination with the Survivin inhibitor YM155. We demonstrated that the combination of MDM2 and Survivin inhibition reduced neuroblastoma cell viability and led to synergistic CI values. The migratory ability of neuroblastoma cells was reduced by the combination treatment. Flow cytometric detection of annexin V/propidium iodide (PI) staining, caspase 3 activity and immunoblot-based detection of cleaved PARP demonstrated that combination treatment enhanced apoptosis induction in neuroblastoma cell lines. Stable, ectopic dn-TP53 expression attenuated RG7388 single-agent treatment but did not affect apoptosis induction mediated by YM155 or combination treatment.

Hintergrund Die Behandlung des Hochrisikoneuroblastoms stellt eines der aktuell wichtigsten Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie dar. Trotz maximaler Ausschöpfung multimodaler Therapieoptionen beträgt die 5-Jahres Überlebensrate der Patienten mit Hochrisiko Neuroblastom ca. 50%, ein Rezidiv oder ein Progress der Tumorerkrankung verlaufen häufig letal. Die Entwicklung neuer, zielgerichteter Therapieansätze ist somit eines der wichtigsten Ziele pädiatrisch onkologischer Forschung. Die gezielte Aktivierung des Tumorsuppressors p53 durch Inhibition des p53 negativ Regulators MDM2 wurde beim Neuroblastom eingehend untersucht. Der Einsatz von MDM2-Inhibitoren als Monotherapie führt jedoch durch die Entwicklung von de novo Mutationen zu Therapieresistenzen. Es ist deshalb von großem Interesse, präklinisch wirksame Kombinationstherapien zu untersuchen, um dauerhaftere Therapieansprachen zu erzielen und gleichzeitig die Toxizität zu reduzieren. Daher haben wir die Wirkung des MDM2- Inhibitors DS3032b in Kombination mit herkömmlicher Chemotherapie und die Kombination des MDM2-Inhibitors RG7388 mit dem Survivin-Inhibitor YM155 untersucht. Die Überexpression von Survivin ist mit einer schlechten Prognose, Metastasierung und Chemotherapieresistenz assoziiert. Dies macht es zu einem besonders attraktiven Ziel zielgerichteter Therapeutika. Diese Arbeit soll präklinische Daten als Basis für den möglichen klinischen Einsatz einer MDM2- Inhibitor basierten Kombinationstherapie liefern. Methoden Die Effekte der Kombinationsbehandlung auf die Zellviabilität, Migration und Apoptose wurden in vitro mit etablierten Neuroblastom-Zelllinien mit unterschiedlich genetischem Hintergrund untersucht. Die Effekte der Kombinationsbehandlung auf die Neuroblastom-Zellviabilität wurden mittels XTT untersucht. Die Zellviabilitätswerte wurden in relative Kombinationswirkungswerte umgewandelt und die CI-Werte wurden mit der CompuSyn-Software gemäß Chou & Talalay (1984) berechnet. Scratch Assays wurden durchgeführt, um die Effekte der Kombinationsbehandlung auf die Migration zu untersuchen. Die Apoptose-Induktion wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Annexin/PI- und Caspase-3-Antikörpern und durch Immunoblot-basierten Nachweis der PARP-Spaltung nachgewiesen. Die p53-Abhängigkeit wurde mit Neuroblastom-Zelllinien getestet, die eine dominant negative TP53-Mutante exprimieren. Die Untersuchung der entsprechenden Zielgen-Expression wurde mittels Western Blot durchgeführt. Ergebnisse Wir untersuchten die Wirkung des MDM2-Inhibitors DS3032b mit herkömmlicher Chemotherapie und konnten eine synergistische Verstärkung der Viabilitätshemmung zeigen. Zur weiteren Charakterisierung haben wir uns auf den klinisch weiter entwickelten MDM2 Inhibitor RG7388 und die Kombination mit dem Survivin-Inhibitor YM155 fokussiert. Wir konnten zeigen, dass die Kombination von MDM2- und Survivin-Inhibition die Viabilität der Neuroblastomzellen reduziert und zu synergistischen CI-Werten führt. Die Migrationsfähigkeit von Neuroblastomzellen wurde durch die Kombinationsbehandlung reduziert. Der durchflusszytometrische Nachweis von Annexin V/Propidiumjodid (PI)-Färbung und Caspase 3- Aktivität sowie der Immunoblot-basierte Nachweis von gespaltenem PARP zeigten, dass die Kombinationsbehandlung die Apoptose-induktion in Neuroblastom-Zelllinien dosisabhängig verstärkt. Stabile, ektopische dn-TP53-Expression schwächte die RG7388-Einzelwirkstoff Behandlung ab, beeinflusste aber nicht die durch YM155 oder die Kombinationsbehandlung vermittelte Apoptose-Induktion.