Susceptibility of staphylococcus aureus strains isolated from cows with subclinical mastitis to different types of disinfectants and antibiotics

Abstract

The primary objective of the current study was to determine in vitro the efficacy of two teat dips, Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dip against 56 Staphylococcus (S.) aureus strains isolated from subclinical cases of bovine mastitis. A further main objective was an attempt of resistance induction of selected strains of S. aureus against the same two types of teat disinfectants. Another objective was to test the antibiotic resistance patterns of bovine mastitis isolates of S. aureus and coagulase negative staphylococci (CNS). The last objective was to check the possibility of cross- resistance between reduced susceptibility to disinfectants and different types of antibiotics that are commercially available for the treatment of bovine S. aureus mastitis. Quarter milk samples were collected from six dairy herds with high prevalences of S. aureus in the federal state of Brandenburg, Germany. Of each herd, 32 cows in different stages of lactation and different age groups were chosen for sampling. Cows were divided according to the udder teat dipping scheme into three groups. Teats of the first group were dipped in the postmilking teat disinfectant Ujosan® dip; the second group was dipped in Eimü Chlorhexidin® dip, while the third group was kept without dipping (a negative control group). A total of seventy isolates of S. aureus and CNS were identified phenotypically by the tube coagulase test and the Staph ID 32 API system; genotypically by using the polymerase chain reaction (PCR) and the mass spectrally by matrix assisted laser desorption/ionisation- time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOFMS), which was used as a confirmatory method for PCR. After identification of all strains, the minimum inhibitory concentration (MIC) of Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dip against S. aureus strains was determined, using the broth macrodilution method which is indicative of the guideline for examination of chemical disinfectants in the German Veterinary Association (Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, DVG). All strains were inoculated in a liquid medium (tryptose soya broth, TSB), serially diluted with the two teat dips. The mean MIC values of Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dip for dipped and control groups were 45.70 ± 2.54%; 42.6 ± 1.64% and 97.51 ± 0.98%; 96.8 ± 0.78%, respectively. This study showed that there was no significant difference (p<0.05) between dipped and negative control groups for both Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dip. The main objective was to induce in vitro sensitivity reduction (resistance) of the same two commercial teat dips with sub-lethal concentrations against ten different strains of S. aureus. For each disinfectant, 10 strains were repeatedly passed 10 times in growth media with sub lethal concentrations of Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dip. The MIC values of the teat dip after passages were determined and compared with the original MIC values before passages. According to the results, 9 strains (90%) became nonsusceptible to Ujosan® dip and only one strain (10%) became nonsusceptible to Eimü Chlorhexidin® dip. All isolates with a significant increase (p>0.001) of MICs were passed every day for 10 days in tryptose soya broth (TSB) without disinfectant (active substance), to check whether the acquired resistance was stable or not. Stability of acquired resistance was noticed in all Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dip adapted S. aureus strains. Furthermore, the sensitivity of 6 selected antimicrobial agents against 70 coagulase positive S. aureus and CNS strains was checked using the agar disk diffusion test. 85.71% of S. aureus strains and 28.57% of CNS were resistant to Penicillin G, 7.14% of S. aureus and CNS were resistant to tetracycline and only 10.71% of S. aureus and 7.14% of CNS were resistant to gentamycin. The percentages of resistant S. aureus and CNS to chloramphinicol were 1.78% and 7.14%, respectively. No resistance was detected for the other tested antimicrobial agents (oxacillin and erythromycin). Finally the current study investigated whether Ujosan® dip-and Eimü Chlorhexidin® dipadapted S. aureus strains were also resistant to antibiotics commercially available for the treatment of bovine S. aureus mastitis. According to the results obtained from the Federal Institute for Risk Assessment (Berlin, Germany), all Ujosan® dip and Eimü Chlorhexidin® dipadapted S. aureus strains showed in vitro the highest susceptibility to all types of antibiotics. Therefore, prolonged exposure of sub-inhibitory concentrations of Ujosan® dip or Eimü Chlorhexidin® dip did not increase emerging antibiotic resistance in S. aureus. The current results and published data indicate that more detailed investigations on the cross- resistance between reduced susceptibility of chemical disinfectants and antibiotics are needed.

Das Ziel der Studie war zunächst, die Wirksamkeit von zwei Zitzendippmitteln (Zitzendesinfektionsmittel), Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip, gegenüber 56 Staphylococcus (S.) aureus-Stämmen, die von subklinischen Fällen boviner Mastitis isoliert wurden, zu bestimmen. Ein weiteres Ziel war, eine Resistenzinduktion bei ausgewählten Stämmen von S. aureus gegen Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip zu versuchen. Ein drittes Ziel bestand darin, die Antibiotikaresistenz von S. aureus und koagulasenegativen Staphylokokken (KNS)-Isolaten von Kühen mit Mastitis zu testen. Viertes Ziel war es, die Möglichkeit der Kreuzresistenz zwischen verminderter Empfindlichkeit gegenüber Ujosan®dip und Eimü Chlorhexidin® dip und verschiedenen Arten von Antibiotika, die für die Behandlung von boviner S. aureus-Mastitis kommerziell verfügbar sind, zu testen. Viertelmilchproben wurden aus sechs Milchkuhbeständen mit hoher Prävalenz von S. aureus im Bundesland Brandenburg (Deutschland) gesammelt. Von jeder Herde wurden 32 Kühe in verschiedenen Stadien der Laktation und unterschiedlichen Altersgruppen für die Probenahme ausgewählt. Die 32 Kühe lassen sich in drei Gruppen aufteilen. Die Zitzen der Kühe aus der ersten Gruppe wurden nach dem Melken in das Zitzendesinfektionsmittel Ujosan® dip getaucht, in der zweiten Gruppe wurde dafür Eimü Chlorhexidin® dip verwendet, in der dritten Gruppe wurde kein Zitzendipmittel angewendet. Insgesamt 70 Isolate von S. aureus und KNS wurden phänotypisch durch Röhrchen- Koagulase-Test und Staph ID 32 API-System identifiziert. Auch wurden diese Isolate mit Hilfe von Polymerase-Kettenreaktion und der Matrix-unterstützten Laserdesorptions/ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie, (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry, MALDI-TOFMS), die als ein Bestätigungsverfahren für die PCR-Methode verwendet wurde, genotypisch identifiziert. Nach der Identifizierung aller Stämme, wurde die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip gegen S. aureus-Stämme mit Benutzung der Bouillon-Makrodilutionsmethode entsprechend den Richtlinien zur Prüfung von chemischen Desinfektionsmitteln der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) von 2000 ermittelt. Die Mittelwerte der MHK von Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip für die Dip-Gruppen- und Kontrollgruppen waren respektiv 45,70 ± 2,54%; 42,6 ± 1,64% und 97,51 ± 0,98%; 96,8 ± 0,78%. Diese Studie zeigte, dass es keine signifikanten Unterschiede (p<0,05) zwischen den Isolaten der Gruppen mit Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip und den Isolaten aus der Kontrollgruppe. Das Hauptziel war, in vitro die Reduktion der Empfindlichkeit (Resistanz) mit subletalen Konzentrationen von Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip bei Stämmen von S. aureus zu induzieren. 10 Stämme wurden 10-mal in Nährmedien mit subetaler Konzentration von Ujosan® dip und Eimü Chlorhexidin® dip passagiert. Die MHK-Werte der Zitzendipmittel wurden nach dem Passagieren bestimmt und mit den MHK-Werten vor den Passagen verglichen. 9 Stämme (90%) wiesen eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Ujosan® dip auf und nur 1 Stamm (10%) hatte eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber Eimü Chlorhexidin® dip. Alle Isolate mit signifikantem Anstieg (p>0,001) der MHK- Werten wurden 10 Tage hintereinander in Tryptose-Soja-Bouillon (TSB) ohne Ujosan® dip bzw. Eimü Chlorhexidin® dip l passagiert, um zu prüfen, ob die erworbene Resistenz stabil oder nicht stabil war. Die Stabilität der erworbenen Resistenz wurde in allen dem Ujosan® dip und dem Eimü Chlorhexidin® dip angepassten S. aureus-Stämmen festgestellt.