Follicular penetration of nano-sized particulate FA-PLGA and the dye RhBITC in dorsal dog and rat skin, and porcine ear skin as an in vitro model for the human integument

Abstract

The skin as the outermost covering of the body provides a compliant and painless interface for topical drug administration. It is well established that pharmaceutical agents applied to its surface spread throughout the upper corneocyte layers by diffusing into the lipid matrix of the stratum corneum. Recent studies have evidenced the hair follicles to be effective shunt routes for the transportation of topically applied substances to deeper skin layers and long-term storage reservoirs for drugs in a number of laboratory animals and humans. Interest in the hair follicles as target structures is aimed at their use as depots for localized treatments of disorders including skin diseases and follicle-related disorders, as well as for systemic drug delivery by targeting of the capillary networks and immune and stem cells found in the vicinity of the skin appendages. Research is increasingly focussed on the development of nano-sized particulate drug delivery systems loaded with therapeutic agents customized to target the hair follicles. In the follicular canal, particulates are shielded from abrasion, enabling drug retention and long-term drug release. The success and efficacy of follicular penetration is largely determined by the numbers, distributions, morphometries and activities of the hair follicles found in the treated skin, as well as the skin constitution, the agent itself and the mode of application. In spite of the obvious abundance of follicular target structures and the comparatively large follicular reservoir, only very few studies have been conducted on the follicular penetration of nano-sized drug delivery systems in companion and farm animals. In the first part of this work, the penetration of topically applied, nano-sized particulates into the hair follicles of excised dog, rat and porcine skin was investigated. The formulations used consisted of FA-PLGA particles sized 256 nm and 430 nm suspended in hydrocellulose gels. Subsequent to application of the formulations to the skin samples using massage, the particles were visualized in cross-sections of the treated skin using a laser scanning microscope, and the follicular penetration depth was determined digitally. FA-PLGA particles were found to penetrate into 60 to 70% of the hair follicles of all skin samples investigated, corresponding to ‘active’ hair follicles receptive to penetration. The results indicated that the follicular penetration depths of the particulate formulations correlated positively with the sizes of the follicular orifices and the lengths of the infundibula in the examined skin samples. Studies have shown that the follicular openings are widest in porcine skin, followed by dog and rat skin, respectively. The hair follicle infundibula extend deepest into the skin of the pig, while in the dog they reach about half, and in the rat, about one- fourth the length of the infundibula found in porcine hair follicles. This is consistent with results of this study in which the particulates penetrated deepest into porcine hair follicles, and least deep into the hair follicles of the rat. While the two FA-PLGA formulations used in this study differed solely in the size of the FA-PLGA particles, no clear trends could be substantiated suggesting that the size significantly influenced follicular penetration. The hair coat, sebaceous glands, tight junctions and capillary networks of the skin samples, as well as the aggregation, degradation and marker leakage properties of the particulates were discussed as additional potential factors influencing follicular penetration of particulate FA-PLGA. The quantification of topically applied agents located in the follicular canals is crucial for questions pertaining to administration, concentrations and dosages for follicular penetration experiments. To date, no procedure exists by which follicular contents can be quantified in porcine skin commonly used as a model for the human integument. Excised porcine skin is a particularly suitable alternative to human skin, as its follicular reservoir capacity corresponds to that of living human skin. In the second part of this study, the established method of differential stripping was modified using tape stripping and an extraction technique. This enabled the selective quantification of the dye RhBITC, which was implemented as a model drug and located in the hair follicles of porcine skin subsequent to topical administration. An average of 5% of the dye applied to the skin was extracted from the follicular canals with ethanol and detected using a fluorescence spectrometer, which was in accordance with results from previous studies, substantiating the efficacy of the developed method.

Die Haut als äußerste Schutzschicht des Körpers stellt eine breite Kontaktfläche für topisch applizierte Substanzen dar. Es ist bekannt, dass pharmazeutische Agenzien, die auf die Hautoberfläche aufgetragen werden, sich in den oberen Korneozytenschichten verteilen, indem sie in die Lipidmatrix des Stratum corneums diffundieren. Neueste Studien haben gezeigt, dass Haarfollikel effektive Transportrouten von oberflächlich aufgetragenen Wirkstoffen zu tiefer gelegenen Hautschichten und Langzeitreservoire für phamazeutisch aktive Substanzen in einigen Versuchstieren und im Menschen darstellen. Das Interesse an den Haarfollikeln als Zielstrukturen orientiert sich an ihrer Verwendung als Depots für lokalisierte Behandlungen von Störungen wie Hauterkrankungen und haarfollikelassoziierte Krankheiten, und an der zielgerichteten systemischen Anreicherung von Wirkstoffen in den follikulären Blutkapillaren und den Immun- und Stammzellen in der Umgebung der Hautanhangsdrüsen. Forschungsaktivitäten konzentrieren sich vorwiegend auf die Entwicklung von Systemen zur zielgerichteten Medikamentenabgabe mit maßgeschneiderten Partikeln im Nanobereich, die mit für Haarfollikel therapeutischen Agenzien angereichert sind. Im follikulären Kanal sind die Partikel vor Abschilferung geschützt, wodurch eine Wirkstoffretention und eine langfristige, kontrollierte Wirkstoffabgabe gewährleistet wird. Der Erfolg und die Wirksamkeit der Follikelpenetration wird weitgehend durch die Anzahl, Verteilung, morphometrischen Eigenschaften und Aktivität der Haarfollikel, die in der behandelten Haut vorhanden sind, sowie durch die Konstitution der Haut, den Wirkstoff selbst und die Anwendungsform bestimmt. Trotz der offensichtlichen Fülle von follikulären Zielstrukturen und des vergleichbar großen follikulären Reservoirs wurde bisher die Penetration von Partikeln im Nanobereich in die Haarfollikel von Haus- und Nutztieren nur in wenigen Studien bearbeitet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde daher die Penetration topisch applizierter Partikel im Nanobereich in die Haarfollikel von exzidierter Hunde- und Rattenhaut sowie im Schweineohr untersucht. Die verwendeten Formulierungen bestanden aus in Hydrozellulosegelen suspendierten FA-PLGA Partikeln der Größen 256 nm beziehungsweise 430 nm. Nach Aufbringen der Formulierungen auf die Hautproben durch Massage wurden die Partikel in Querschnitten der behandelten Haut mit einem Laserscanningmikroskop erfasst, und die follikulären Penetrationstiefen digital bestimmt. Die FA-PLGA Partikel penetrierten in 60 bis 70% aller untersuchten Haarfollikel, die mit der Anzahl der ‚aktiven’ Haarfollikel, die für die Penetration zugänglich sind, in Zusammenhang stehen. Studien haben gezeigt, dass die follikulären Penetrationstiefen der partikulären Formulierungen mit den Größen der Haarfollikelöffnungen und der Längen der Infundibula in den untersuchten Hautproben positiv korrelieren. Die Haarfollikelöffnungen sind beim Schwein am größten, und bei der Ratte am kleinsten. Die Infundibula sind in der Haut des Schweins am längsten. Im Hund erreichen sie ungefähr die Hälfte, und in der Ratte ungefähr ein Viertel der Länge der Infundibula des Schweins. Diese Erkenntnisse stimmen mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie überein, in der die Partikel am tiefsten in die Schweinehaarfollikel penetriert und am geringsten in die Rattenhaarfollikel eingedrungen sind. Obwohl die zwei Formulierungen, die in der Studie verwendet wurden, sich ausschließlich in der Größe der FA-PLGA Partikel unterschieden haben, konnten keine klaren Trends identifiziert werden, die auf einen signifikanten Einfluss der Größe auf die follikuläre Penetration hinweisen. Das Haarkleid, die Talgdrüsen, die Tight Junctions und die Kapillarnetzwerke der Hautproben, sowie die Aggregation, der Abbau und der Markerverlust der Partikel wurden in dieser Arbeit als zusätzliche Faktoren, die die follikuläre Penetration der FA-PLGA Partikel beeinflussen, diskutiert. Die Quantifizierung oberflächlich angewandter Wirkstoffe, die in den follikulären Kanälen lokalisiert sind, ist essentiell für Fragen zu Anwendungen, Konzentrationen und Dosierungen für follikuläre Penetrationsversuche. Zurzeit existieren keine Methoden, bei denen die follikulären Inhalte der Schweinehaut, die üblicherweise als Modell für die menschliche Haut dient, quantifiziert werden können. Exzidierte Schweinehaut ist eine besonders geeignete Alternative zur menschlichen Haut da die Kapazität des follikulären Reservoirs mit dem der lebenden Humanhaut vergleichbar ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die etablierte Methode des Differential Strippings unter Verwendung der Abrißmethode und einem Extraktionsverfahren modifiziert. Dies erlaubte die selektive Quantifizierung des Farbstoffes RhBITC, der als Modellsubstanz implementiert wurde, und nach topischer Applikation in den Haarfollikeln der Schweinehaut lokalisiert war. Durchschnittlich 5% des Farbstoffes, der auf die Haut aufgebracht wurde, konnte von den follikulären Kanälen mittels Ethanol extrahiert und unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers bestimmt werden. Diese Daten waren in Übereinstimmung mit früheren Studien, womit die Wirksamkeit der entwickelten Methode belegt wurde.