Analyse der Zellzykluskontrolle und DNA-Schadensantwort bei autosomal rezessiver MCPH1-Defizienz

Abstract

Die primäre autosomal-rezessive Mikrozephalie (MCPH) ist eine genetisch heterogene neuronale Entwicklungsstörung, die klinisch durch eine erhebliche Reduktion des Gehirnvolumens und eine nicht progressive mentale Retardierung charakterisiert ist. Mutationen im MCPH1-Gen führen in proliferierenden Zellen zu einem stark erhöhten Anteil Prophase-ähnlicher Zellen, der auf eine vorzeitige Chromosomenkondensation in der frühen G2-Phase und eine verzögerte Dekondensation nach der Mitose zurückzuführen ist. Außerdem scheint MCPH1 in die Zellzykluskontrolle und DNA-Schadensantwort involviert zu sein. Einige Veröffentlichungen beschreiben einen defekten G2/M-checkpoint sowie eine Herunterregulierung von BRCA1 und CHK1 nach RNAi gegen MCPH1. Eine fehlerhafte Antwort auf DNA-Schäden aufgrund von MCPH1-Mutationen wäre für die Prognose der Patienten von großer Bedeutung, weil sie mit einem deutlich erhöhten Tumorrisiko einhergehen würde. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse des G2/M-checkpoints sowie mit der Expression der Zellzyklusproteine BRCA1 und CHK1 in lymphoblastoiden MCPH1-Patientenzellen. Die Untersuchungen der relativen Protein- und RNA-Mengen mittels Westernblot und quantitativer Real Time PCR zeigten eine normale Expression sowohl von BRCA1 als auch von CHK1 in MCPH1-Patientenzellen. Außerdem wurde nach ionisierender Bestrahlung dieser Zellen der G2/M-checkpoint mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dabei konnte für die Patientenzellen ein intakter G2/M-checkpoint nachgewiesen werden. Die Zellzyklusanalyse zeigte bei den Patientenzellen eine normale Verteilung der Zellzyklusphasen. Die Verschiebungen nach ionisierender Bestrahlung zugunsten der S-Phase weisen auf einen intakten Intra-S-Phase- checkpoint hin. Die einzige Auffälligkeit bei den Patientenzellen, die auf eine fehlerhafte DNA-Schadensantwort hindeutet, ist deren verzögerter Wiedereintritt in den Teilungszyklus nach Bestrahlung. Dies könnte ein Hinweis auf eine gestörte oder zumindest verlangsamte DNA-Doppelstrangbruchreparatur sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein schwer wiegender DNA-Schadens- Kontrollpunktverlust in MCPH1-Patientenzellen ausgeschlossen werden. Daher muss bei den Patienten nicht von einem erheblich erhöhten Risiko für die Ausbildung maligner Erkrankungen ausgegangen werden. Diese Erkenntnis steht im Einklang mit der Beobachtung, dass keiner der bisher bekannten Patienten eine Krebserkrankung entwickelt hat.

Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a genetically heterogeneous neurodevelopmental disorder, which is clinically characterized by a marked reduction in brain size and non-progressive mental retardation. MCPH1 seems to be involved in cell cycle control and the DNA damage response; several publications describe a defective G2/M checkpoint and a downregulation of BRCA1 and CHK1 after knockdown of MCPH1 by RNAi. Mutations in MCPH lead to premature chromosome condensation in early G2 phase and delayed decondensation post-mitosis, resulting in a high percentage of prophase-like cells in chromosome preparation. A defective response to DNA damage due to MCPH1 mutations would be of prime importance for patients, as it would considerably increase their cancer risk. Here, we analyze the G2/M checkpoint as well as the expression of the DNA damage response and cell cycle proteins BRCA1 and CHK1 in lymphoblastoid MCPH1 patient cells. Western blotting and quantitative Real-time PCR showed a normal expression of BRCA1 and CHK1. We next examined the G2/M checkpoint, by subjecting the cells to ionizing radiation and performing cell cycle analysis by flow cytometry. Here we found an efficient G2/M checkpoint. Cell cycle analysis indicated a normal cell cycle distribution. The shift in favour of the S phase suggests an intact Intra-S-phase checkpoint. The only indication of a possibly deficient DNA damage response was the delayed re-entry of patient cells into cell cycle after ionizing radiation. This could indicate slowed or disrupted DNA double strand-break repair. These results show that MCPH1 patient cells do not have a markedly defective DNA damage checkpoint defect. We can therefore conclude that MCPH1 patients do not have a significantly increased risk of developing malignant diseases. This finding is in accordance with the absence of malignancies in MCPH1 patients.