Matrix-gestützte Laser-Desorption und Ionisation (MALDI) mit ultrakurzen Laserpulsen

Abstract

Seit seiner ersten Beschreibung ist MALDI (von Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) in Kombination mit Massenspektromentrie eine der wichtigsten Analysemethoden im Bereich der Biochemie, der Physiologie und der Polymerforschung geworden. Mittels MALDI ist es moeglich, große fragile Molekuele unbeschadet in die Gasphase zu bringen und dabei einen kleinen Teil durch Protonierung mit einer positiven Ladung zu versehen. Trotz der weiten Verbreitung ist der Ionisation waehrend MALDI noch nicht vollstaendig verstanden. MALDI setzt sich aus mehreren Prozessen wie Absorption des Laserpulses, Desorption/Ablation der MALDI-Probe und Ionisation zusammen. Die meisten Studien ueber MALDI werden mit ns-Laserpulsen durchgefuehrt. So koennen Prozesse in kuerzeren Zeitspannen (wie die Absorption) nur ungenau untersucht werden. Mit (geformten) ultrakurzen Laserpulsen ist es jedoch moeglich, schnelle chemische und physikalische Prozesse zu untersuchen. Daher soll in dieser Arbeit MALDI durch eine Bestrahlung der MALDI-Probe mit Femtosekunden-Laserpulsen im UV und nahen IR untersucht werden. MALDI kann mittels ultrakurzen Laserpulsen der Zentralwellenlaengen λ=400nm (UV) und (λ=800nm) (nahes IR) beobachtet werden. Dies ist insofern ueberraschend, da die verwendeten Matrixsubstanzen nahezu keine Absorption im nahen IR zeigen. Durch MALDI-Experimente mit verschiedenen Pulsdauern wird dieser Effekt als zweiphotonische Absorption der λ=800nm-Laserpulse durch die Matrix erklaert. Weitere Experimente untersuchen die Kationisierung von Angiotensin II fuer verschieden Laserpulsenergien und Pulsdauern f¨ur die Wellenlaengen λ=337nm (ns- Laserpulse) und fuer fs-Laserpulse der Zentralwellenlaengen λ=400nm und λ=800nm. Steigende Pulsenergien fuehren demnach zu hoeheren Kationisierungstendenzen (das ist der Quotient des Ionensignals von kationisiertem und protoniertem Angiotensin II). Fuer ultrakurze Laserpulse der Zentralwellenlaenge λ=800nm kann fuer die Kationisierungstendenz die Abhaengigkeit: [Ang+K]/Ang+H]∝(E^2±0,2)/(τ^0,47±0,1) ermittelt werden. Trotz der hohen Schwankung des Ionensignals bei MALDI ist es moeglich, die Methode der kohaerenten Kontrolle zur Untersuchung der Kationisierung von Angiotensin II zu realisieren, um die Ergebnisse vorangehender Untersuchungen zu bestaetigten. Um die Bindungsstellen der Kationen an Angiotensin II in der Gasphase zu ermitteln, werden PSD-Massenspektren (von Post Source Decay) gezeigt und die Ergebnisse mit Molekueldynamik-Simulationen verglichen. Eine Stabilisierung der sekundaeren Struktur durch z.B. ein oder mehrere Caesium- Kationen begruendet eine geringere Fragmentierung der Alkalimetall-adaptiertem Angiotensin II in der Gasphase. In einem weiteren Kapitel wird der Matrix- Suppression-Effekt (MSE) mit Hilfe von geringen Konzentrationen von Tetraalkylammoniumhalogeniden (TAAH) in der MALDI-Probe untersucht. Durch eine Bestrahlung der MALDI-Probe mit ns- und fs-Laserpulsen koennen weitere Hinweise auf die Konzentration der TAAH an der Oberflaeche der MALDI-Probe gefunden werden. Untersuchungen von Phthalocyanin (PcH2) und Eisen(II)-Phthalocyanin (PcFe) bilden das Thema des letzten Kapitels. Diese Substanzen lassen sich sowohl durch MALDI als auch ohne die Verwendung einer Matrixsubstanz, durch Laser Desorption/Ionization (LDI) in die Gasphase ueberfuehren. Es kann die Adaption von Sauerstoff an PcFe durch das Auftreten eines [PcFe(IV )=O]-Komplexes, sowie die Dimer-Bildung [PcFe(III)-O-Fe(III)Pc] beobachtet werden. Die Dimerbildung ist bei MALDI deutlich staerker als bei LDI ausgepraegt. Dies veranschaulicht direkt die Puffer-Wirkung durch die Matrixsubstanz fuer einen schonenden Uebergang der Analytmolekuele in die Gasphase bei MALDI. Im letzten Teil wird die Fragmentierung von PcH2 und PcFe durch Bestrahlung mit fs- Laserpulsen der Zentralwellenlaenge λ=800nm beschrieben.

MALDI (von Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) in combination with mass spectrometry is an important method for mass analysis in biochemistry, physiology, and polymer research. With MALDI, large and fragile molecules can be brought into the gas-phase. The protonated analyte molecules can be detectet after MALDI. Despite its wide application, the underlying MALDI processes is still not fully understood. MALDI contains absorption, desorption/ablation, and ionization. Most studies about MALDI have been done with nanosecond (ns) laser pulses. By irradiating the MALDI sample with ns- aserpulses, fast processes could only examined unprecisely. By using (shaped) femtosecond (fs) laser pulses, it is possible to examine ultrafast chemical and physical processes. Therefore MALDI is examined by using ultrashort laser pulses. MALDI mass spectra could be obtained by ultrashort laser pulses in the UV (λ=400nm) and in the near IR (λ=800nm). MALDI in the near IR is unexpected, because the used matrix substances show almost no absorption in this wavelength regime. By using different pulse durations, this phenomenon can be explained by two photon absorption of the laser pulses. Further experiments examine the cationization process (the adaption of a cation to the analyte molecule during MALDI) of angiotensine II as a function of the pulse duration and pulse energy for the (central) wavelangths λ=337nm (τ=3ns), λ=400nm (τ=60fs), and λ=800nm (various pulse durations), respectively. For ultrashort laser pulses in the near IR, the cationizatoin tendency has figured out to [Ang+K]/[Ang+H]∝(E^2±0,2)/(τ^0,47±0,1). MALDI has a low signal-to-noise level. However, it was possible to verify these results by using the coherent control method. With a combination of Post Source Decay (PSD) measurements and geomety optimizations on the semi-empirical level of theory, the positions of cations at the angiotensin II molecule have been clarified. Electrostatic interaction between the Cs cation(s) and the heterocyclic amino acids stabilize the secondary structure of angiotensine II. This seems to be the reason for less fragmentation of cationized in comparisson to protonated angiotensine II in gas phase. The Matrix Suppression Effect (MSE) and the Analyte Suppression Effect have been examined by addition of a low concentration of quarternary ammonium salts to the MALDI sample. By irradiating the MALDI sample with ns- and fs laser pulses, further arguments for the concentration of the quarternary ammonium cations near the surface of the MALDI sample have been found. MALDI and LDI (von Laser Desorption/Ionization) studies of phthalocyanin (PcH2) and iron(II)-phthalocyanin (PcFe) are described in the last chapter. The obtained mass spectra show an adaption of oxygen to PcFe. Mass spectra show the formation of [PcFe(IV )=O] and the formation of a dimer structure [PcFe(III)-O-Fe(III)Pc]. In MALDI mass spectra, the dimer signal is much more intensive than in LDI mass spectra. This shows the buffering effect of matrix substance during desorption/ablation. The fragmentaion of PcH2 and PcFe has been examined in the last part of this chapter by irradiating the LDI sample with fs laser pulses.