Charakterisierung der metabolischen Aktivierung und biologischen Wirkung von Benzo[a]pyren in der Haut

Abstract

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind ubiquitär auftretende Schadstoffe in der Umwelt. Unter den PAK wird Benzo[ a]pyren (BP) seit Jahrzehnten als Leitsubstanz betrachtet und ist daher intensiv erforscht. Die Exposition des Menschen gegenüber BP kann auf unterschiedlichen Wegen erfolgen: über die Atemluft, die Nahrung oder durch den Kontakt mit kontaminiertem Material. In den Körper aufgenommen wird BP durch Enzyme des Fremdstoffmetabolismus metabolisch aktiviert und es kommt zur Bildung von Derivaten, die zytotoxische und/oder genotoxische Effekte hervorrufen können. BP als starker Agonist des Arylhydrocarbon Rezeptors (AHR) kann unterschiedliche zelluläre Effekte auslösen, bedingt durch die Bildung toxischer Metabolite oder direkt über die Aktivierung des AHR. Der AHR ist neben dem Fremdstoffmetabolismus an einer Vielzahl intrazellulärer Signalwege, wie Inflammation, Apoptose, Differenzierung und Proliferation, beteiligt. In der Haut spielen physiologische Apoptose-Induktoren, wie Cluster of Differentiation 95 Ligand (CD95L) und TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL), eine wichtige Rolle bei der Entstehung entzündlicher Hautkrankheiten. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Kompetenz von kommerziell erhältlichen in vitro Hautmodellen, primären Keratinozyten und ex vivo Humanhaut hinsichtlich der Metabolisierung von BP verglichen werden. Sowohl kommerziell erhältliche in vitro Hautmodelle, primäre Keratinozyten und Fibroblasten als auch ex vivo Humanhaut sind in der Lage BP effektiv zu metabolisieren. Mittels LC-MS/MS konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung von BP und die damit verbundene Bildung komplexer Metabolitenmuster in den untersuchten 3D- Hautmodellen eine sehr große Ähnlichkeit zu der menschlichen Haut aufweist und in diesem Punkt die in vivo Situation deutlich besser widerspiegeln als die untersuchten primären Zellkulturen. Dagegen war in primären Zellkulturen und 3D -Hautmodellen nach dermaler Exposition gegenüber BP gleichermaßen eine signifikant erhöhte Genotoxizität nachweisbar. Neben der direkt durch die reaktiven Metabolite ausgelösten "Damage Response" kann es durch die PAK- abhängige Aktivierung von AHR-Signalwegen zu Veränderungen verschiedenster zellulärer Reaktionen kommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der pro- apoptotische Effekt von BP in primären Keratinozyten und HaCaT-Zellen näher charakterisiert. Obwohl BP alleine in Keratinozyten nur eine niedrige Apoptoserate auslöste, wurde eine verstärkte Sensibilisierung gegenüber den physiologischen Apoptose- Induktoren CD95L und TRAIL beobachtet. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Sensibilisierung der Keratinozyten für CD95L- und TRAIL-bedingte Apoptose durch BP nicht in der Bildung genotoxischer Metabolite und der dadurch ausgelösten Aktivierung von p53 begründet ist. Die Abhängigkeit der beobachteten Sensibilisierung vom AHR wurde im Rahmen dieser Arbeit mittels AHR-defizienter HaCaT-Zellen, in denen der Sensibilisierungseffekt nicht auftrat, gezeigt. Dieser Befund konnte auch mit dem nicht-genotoxischen AHR-Agonisten β-Naphtoflavon (β-NF) bestätigt werden. Die gewonnenen Ergebnisse liefern klare Hinweise darauf, dass AHR-Liganden in der menschlichen Haut die apoptotischen Effekte physiologischer Apoptose- Induktoren verstärken können und belegen damit eine neue Funktion des AHR im zellulären Apoptose-Prozess.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are ubiquitous environmental pollutans, whose lead compound is the most thoroughly investigated benzo[ a]pyrene (BP). Exposure to BP can occur via air, food or contacts with contaminated products. Upon uptake BP is enzymatically metabolized toward reactive intermediates that can induce cytotoxicity and/or genotoxicity. BP is a strong agonist of the aryl hydrocarbon receptor (AHR) and can therefore initiate multifarious cellular effects, due to formation of toxic metabolites or directly via activation of AHR. Besides its essential role in the biotransformation of xenobiotics, the transcription factor AHR modulates a multitude of intracellular signaling pathways, like inflammation, apoptosis, differentiation or proliferation. In the skin, physiological inducers of apoptosis like CD95L and TRAIL play an important role in in the pathology of inflammatory skin diseases. In this PhD thesis, BP metabolism in commercially available in vitro 3D skin models, primary 2D skin cell cultures and excised human skin was compared, and the occurrence of seven different BP metabolits by means of liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry was analyzed. All models investigated were competent to metabolize BP. The metabolic profiles generated by the skin models were remarkably similar to the ex vivo human skin. Therefore 3D skin models refect the in vivo situation better than the skin-derived cell culture models. Upon dermal exposure significant amounts of BP-derived DNA damage in skin-derived cell culture models and 3D skin models was detectable. Besides damage responses triggered by reactive intermediates, PAH-mediated activation of AHR signaling can also more directly trigger changes in diverse cellular pathways. Within this thesis the pro-apoptotic function of BP in primary keratinocytes and HaCaT cells was further characterized. Although BP failed to induce apoptosis in keratinocytes, a strong enhanced sensitization toward the physiological inducers of apoptosis, CD95L and TRAIL, was observed in BP-treated cells. Enhancement of CD95- and TRAIL-mediated apoptosis by BP did not depend on the formation of genotoxic metabolites and the assoziated activation of p53. The BP induced sensitization occurred. Further, β-NF, a non-genotoxic activator of AHR signaling was also shown being capable of increasing death receptor- dependent apoptosis. The results obtained in this PhD thesis provide clear evidence that receptor-induced apoptosis can be modulated by environmentally relevant AhR agonists such as BP, the carcinogenic lead compound from the class of PAHs. It thus describes a new aspect of the role of AHR in apoptosis. Sensitization of CD95L- and TRAIL-induced apoptosis fully depends on the presence of an active AHR, confirmed by AHR-deficient HaCaT cells, in which no sensitization occurred. Further, β-NF, a non-genotoxic activator of AHR signaling was also shown being capable of increasing death receptor-dependent apoptosis. The results obtained in this PhD thesis provide clear evidence that receptor-induced apoptosis can be modulated by environmentally relevant AhR agonists such as BP, the carcinogenic lead compound from the class of PAHs. It thus describes a new aspect of the role of AHR in apoptosis.