Dissecting the role of Brachyury in Axial Elongation of the Mouse Embryo

Abstract

The vertebrate body is laid down in a head to tail fashion by cells emerging from a growth zone at the posterior end of the embryo. This domain contains progenitor reservoirs providing the cellular material for axial elongation as well as the posterior notochord, which organizes the nascent tissues. The developmental master regulator Brachyury (T) controls progenitor maintenance, mesoderm formation and the specification of the notochord in a dosage dependent manner. How these different activities of T are regulated is not fully understood. In this study, I systematically dissected the gene regulatory landscape of the mouse T locus, where an enhancer cluster upstream of the T gene was mapped using ChIP-Seq. Employing the CRISPR/Cas9 system, I show that deletion of this regulatory region disrupts notochord development and tail outgrowth. Within this region, I identified a critical notochord enhancer. The enhancer mutants display axis truncation phenotypes that are consistent with the necessity of high T levels for notochord maintenance and the essential role of the notochord in axis extension.

Progenitors for axial tissues of different lineages are closely associated with the posterior notochord in a conserved topological arrangement. It has been proposed that the presumptive notochord provides the niche for axial progenitors and that these two cell groups together function as the organizer of trunk and tail development. To explore this concept, I analyzed the expression profile of nascent notochord, marked by a Noto reporter. Noto+ cells are the source of combinatorial Shh, Nodal, Fgf, Wnt and apelinergic signaling as well as BMP antagonists. The expression of some of these signals peaks at the stages of development when progenitor cells are amplified, indicating a role for Noto+ cells in this process. Further, I investigated the activity of the pluripotency factor Oct4 by light sheet microscopy throughout axial elongation, revealing a novel expression domain in a subset of progenitor cells in the early tail bud. RNA-Seq suggests that co-expression of Oct4, Sox2 and T represents an axial stem cell signature.

Taken together, axial elongation is driven by interactions of Noto+ cells and progenitors. Differentially regulated activities of Brachyury are essential for every aspect of this process.

Der Körper von Wirbeltieren wird entlang der rostrokaudalen Achse von Zellen aus einer Wachstumszone am hinteren Ende des Embryos angelegt. Diese Domäne enthält Reservoirs von Vorläuferzellen, die das Zellmaterial für die Achsenverlängerung generieren, sowie das posteriore Notochord, das die entstehenden Gewebe organisiert. Der für die Entwicklung maßgebliche Transkriptionsfaktor Brachyury (T) steuert dosisabhängig die Erhaltung der Vorläuferzellen, die Mesodermbildung und die Spezifizierung des Notochords. Wie diese verschiedenen Aktivitäten von T reguliert werden, ist nicht vollständig verstanden. In dieser Studie wurden genregulatorische Elemente des T-Locus in der Maus mittels des CRISPR/Cas9- Systems systematisch zerlegt und so ein Enhancer-Cluster upstream von T anhand von ChIP- Seq Daten lokalisiert. Die Deletion dieser regulatorischen Region verhindert die Entwicklung des Notochords und das Auswachsen der Schwanzknospe. Innerhalb der Region wurde ein essentieller Notochord-Enhancer identifiziert. Die Enhancer-Mutanten zeigen neben anderen Defekten einen vorzeitigen Abbruch der Achsenbildung auf. Folglich werden bestimmte Schwellenwerte an T Expression für die Aufrechterhaltung des Notochords benötigt. Das Notochord wiederum spielt eine essentielle Rolle bei der Aufrechterhaltung der Achsenbildung.

Vorläuferzellen der axialen Gewebe sind in einer konservierten Anordnung eng mit dem posterioren Notochord verbunden. Es ist möglich, dass das präsumptive Notochord die Nische für axiale Vorläuferzellen bildet und diese beiden Zellgruppen zusammen als Organisator der Rumpf- und Schwanzentwicklung fungieren. Um dieses Konzept zu untersuchen, wurde das Expressionsprofil des frühen Notochords mittels eines Noto-Reporters analysiert. Noto+- Zellen sind die Quelle von sekretierten Shh-, Nodal-, Fgf-, Wnt- und Apelin-Signalen, sowie BMP-Antagonisten. Die Expression einiger dieser Signale erreicht ihren Höhepunkt in den Entwicklungsstadien, in denen die Vorläuferzellen expandiert werden, was auf eine Rolle der Noto+-Zellen in diesem Prozess hinweist. Des weiteren wurde die Aktivität des Pluripotenzfaktors Oct4 während der Achsenbildung durch Mikroskopie analysiert, wobei eine bisher unbeschriebene Expressionsdomäne innerhalb der Vorläuferzellen in der frühen Schwanzknospe entdeckt wurde. Transkriptomdaten legen nahe, dass Oct4, Sox2 und T die Genexpressionssignatur einer neuen Klasse axialer Stammzellen bilden.

Zusammenfassend legen die Daten nahe, dass Interaktionen von Notochord- und Vorläuferzellen die Achsenbildung antreiben. Unterschiedlich regulierte Aktivitäten von Brachyury sind für jeden Aspekt dieses Prozesses wesentlich.