Reaktion primärer humaner Endothelzellkulturen unter Einfluss von Antigenen der rheumatoiden Arthritis

Abstract

Hintergrund: Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Systemerkrankung bei der erhöhte Konzentrationen an sE-Selektin, sICAM-1 und sVCAM-1 im Serum bestehen. Dies könnte eine erhöhte Aktivität des Endothels bedeuten. Fragestellung: Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob verschiedene mögliche Autoantigene der RA in der Lage sind, primäre endotheliale Zellen zu aktivieren. Die Aktivierung wurde durch erhöhte Werte an Adhäsionsmolekülen (AM) und Interleukinen (IL) in den Zellüberständen, durch erhöhte Präsentation von AM an der Zelloberfläche an fixierten Zellkulturen und anhand einer gesteigerten Proliferationsrate der Zellen untersucht. Methoden: Humane Endothelzellkulturen aus aortalem und mikrovaskulärem Spendergewebe wurden über Zeiträume von 3, 6, 12, 24 und 48h mit den Antigenen Protein Binding Peptid (BiP), Calpastatin, Fibrinogen, citrulliniertes Fibrinogen, IgG gebundenes Peptid P3, IgM, IgA, IgG und IL-15 inkubiert. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte im Zellüberstand mittels ELISA, sowie an fixierten Zellkulturen durch Immunfluoreszenzfärbung (FITC). Des Weiteren wurden IL-6 und IL-10 durch ELISA-Messung der Überstände quantifiziert. Ergänzend wurde die Proliferation der Endothelzellen durch den Einbau von radioaktiv markiertem Methyl-3H-Thymidin in die DNA evaluiert. Eine Kontrolle erfolgte sowohl anhand nicht-stimulierter Kulturen, als auch mit den Vergleichsantigenen anti-Calpain und citrulliniertem BSA. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigten insgesamt eine relativ hohe Variabilität. Eine eindeutige Aktivierung konnte für die gemessenen Zeiträume nach Stimulation mit IgG, IgM, IgA und IL-15 gezeigt werden. Hierbei kam es zu signifikant erhöhten Konzentrationen an sE-Selektin, sICAM-1 und IL-6. Darüber hinaus bestand eine leichte aber nicht signifikante Verringerung der IL-10 Konzentrationen nach Stimulation mit IL-15. Weitere signifikante positive oder negative Stimulationen zeigten sich nicht ausreichend konstant. Schlussfolgerung: Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es zu einer direkten Aktivierung des Endothels in Form einer erhöhten AM-Expression durch mögliche Autoantigene der RA kommt. Den Anstieg von IL-6 und sE-Selektin durch IgA wäre eine mögliche Erklärung für die in anderen Studien beschriebene Korrelation der IgA-Konzentration im Serum und der Krankheitsaktivität. Die Verringerung der IL-10 Konzentration durch die Stimulation mit IL-15 könnte ein Hinweis auf eine Inhibition anti-inflammatorischer Zytokine sein. Zur Aufklärung der Rolle des Endothels in der Pathogenese der RA werden weitere Untersuchungen benötigt.

Background: Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease showing elevated markers of vascular activation including sE-selectin, sICAM-1 and sVCAM-1, which could point to enhanced endothelial activity. Objectives: The aim of this study was to examine whether seven possible RA autoantigens are capable of activating primary endothelial cells: protein binding peptid (BiP), calpastatin, fibrinogen, citrullinated fibrinogen, IgG-bound peptid P3, IgM, IgA, IgG and IL-15. Activation was measured in terms of increased adhesion molecule and interleukine secretion into cellular supernatants, elevated presentation of adhesion molecules on cell surfaces, and raised cellular proliferation rates. Methods: Human aortical endothelial (HAEC) and human microvascular endothelial (HMVEC) cell lines were incubated for 3, 6, 12, 24, and 48 h. Levels of sE-selectin, sICAM-1, sVCAM-1, interleukine -6 and -10 were measured with ELISA, adhesion molecule presentation on cell surfaces was evaluated on fixed cell cultures with immunofluorescent staining (FITC). Proliferation rates were additionally evaluated by measuring the incorporation of radioactively labeled Methyl-3H-Thymidin. Controls included non- stimulated cultures as well as cultures stimulated with anti-calpain, and citrullinated BSA. Results: Results displayed high overall variability. Evident endothelial activation over the measured periods of incubation could be shown after stimulation with IgG, IgA, IgM, and IL-15 with significantly elevated levels of sE-selectin, sICAM-1 and IL-6 concentrations. Morevover, a slight decrease in the IL-10 concentration occurred after stimulation with IL-15. Significantly positive or negative stimuli could be shown for various other antigens, which, however, were not consistent enough over the respective stimulation periods. Conclusion: For the first time it could be shown that possible autoantigens of the RA cause direct activation of the endothelium, as apparent from higher expressions of adhesion molecules. Additionally, this activation contributes to the local cytokine environment. Elevated secretion of IL -6 and sE-Selectin under the influence of IgA could be a reason for the association between IgA concentrations and disease activity described in other investigations. The decrease in IL-10 secretion after stimulation with IL-15 could indicate an inhibition of anti-inflammatory agents. Further studies are needed to clarify the endothelium’s complex role in the chronic inflammation of RA.