The first part of this study investigated intestinal epithelial barrier in celiac disease (CeD) patients. Intestinal epithelial barrier is altered in CeD. However, the mechanism underlying disrupted barrier function in CeD is not clearly understood. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of human monocytes (CD14+) isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from active and inactive CeD patients on the barrier function of intestinal epithelial cells. For this purpose, PBMCs were isolated from healthy controls, CeD patients on gluten-free diet and active CeD. Monocytes (CD14+) were sorted by MACS magnetic cell sorting. CacoBBe cells were co-cultured with PBMCs and CD14+ cells. Cells were treated with or without IL15/Tglia to verify the role of gliadin stimulation on barrier function. Moreover, CacoBBe cells were treated with IL15/Tglia alone to exclude possible toxic effects of gliadin on the epithelial barrier. Transepitelial electrical resistance (TER) was measured to evaluate the barrier integrity. Confocal microscopy after immunostaining was used to verify the localization of proteins with role in epithelial barrier function (Occludin and ZO-1). Monocytes were characterized by cytokines production and surface markers profile, through FACs analysis. Intestinal epithelial cells co-cultered with celiac monocytes presented a more pronounced decrease in TER in comparison with healthy controls. Also, Intestinal epithelial cells treated with IL15/Tglia alone, as observed in untreated cells, did not present decrease in TER. Decrease in occludin expression and an abnormal structure in ZO-1 were observed after co-culture of intestinal epithelial cells and celiac monocytes. Analysis of cytokine concentrations in monocyte supernatants revealed higher expression of proinflammatory cytokines, mainly interleukin-6 and MCP-1. However, surface marker expression did not reveal significant alterations in celiac monocytes. In conclusion, CeD peripheral monocytes reveal an intrinsically elevated proinflammatory cytokine pattern that is associated with the potential of peripheral monocytes to affect barrier function by altering TJ composition. In the second part of the study, we investigated the impact of IL-22 in the barrier function integrity and cell polarity alterations in intestinal epithelia cells. Several cytokines have been related to directly affect the barrier function. One of these cytokines is IL-22, which might impact the integrity of the epithelial layer. IL-22 leads to the activation of various cellular signaling pathways including STAT-3, MAPK and PI3K/AKT. The effect of IL-22 on epithelial cells concerning cell polarity and barrier defect is not completely understood. Therefore, this study aimed to understand the mechanism underlying the development of dyspolar epithelia and barrier defect caused by IL-22. In order to answer this question, IECs were exposed to IL- 22 at various concentrations. IECs implanted in Matrigel were grown to 3-dimensional cysts in the presence or absence of IL-22 and morphology and expression of polarity proteins were analyzed by confocal microscopy. To evaluate the barrier integrity and tight junction assembly, measurements of transepithelial electrical resistance (TER) and calcium switch experiments were performed. TJ and cell polarity protein expression were assessed by western blotting and confocal microscopy. Cell motility was assessed through migration and invasion assays. Induction of epithelial-mesenchymal transition (EMT) was assessed by RT-qPCR analysis as well as western blotting. Activated signal transduction pathways were identified through Western blotting and inhibitors of STAT3 and MAPK/ERK were applied to uncover the signal transduction of barrier and polarity effects. We observed that IECs exhibited a barrier defect after IL-22 exposure in all tested concentrations. TJ protein distribution and expression were strongly impaired. Delayed recovery in the calcium-switch assay was observed suggesting a defect in TJ assembly. In our 3D-cyst model, multi-lumen and aberrant cysts as well as mislocalization of cell polarity proteins Par-3 and Dlg-1 was observed after IL-22 exposure. IL- 22 induced cell motility with increased in cell migration and invasion as well as induction of EMT. Interestingly, inhibition of the MAPK pathway reverted IL-22 effects rescuing the TJal barrier defect, while blocking STAT3 led to apoptosis. In conclusion, we showed that IL-22 impairs intestinal epithelial cell barrier by inducing EMT, causing defects in epithelial cell polarity and increasing cell motility. Furthermore, we demonstrated that IL-22 modulates TJ protein expression and mediates tight junctional (TJal) barrier defects via ERK pathway.
Der erste Teil dieser Studie untersuchte die Darmepithelbarriere bei Zöliakie (CeD) Patienten. Die Darmepithelbarriere ist bekanntermaßen bei Zöliakie defizient. Allerdings ist der zugrundliegende Mechanismus dieser gestörten Barrierefunktion noch nicht ausreichend erforscht. Ziel dieser Studie war es daher, zur Aufklärung dieses Barrieredefekts beizutragen. Genauer betrachtet wurde die Wirkung humaner CD14-positiver Monozyten, die aus dem peripheren Blut aktiver und inaktiver CeD-Patienten isoliert wurden, auf die epitheliale Barrierefunktion von Darmepithelzellen (IEC) untersucht. Zu diesem Zweck wurden periphere Blut-mononukleäre Zellen (PBMCs) gesunder Kontrollpersonen, CeD-Patienten mit einer glutenfreien Ernährung und CeD-Patienten mit aktiver Erkrankung, isoliert. CD14-positive Monozyten wurden mittels Magnetic-activated cell sorting (MASC) sortiert. Caco2BBe-Zellen wurden mit PBMCs oder mit CD14+ Zellen co-kultiviert. Die Zellen wurden zudem ±IL15/Tglia behandelt, um eine Gliadinabhängigkeit der epithelialen Barrierefunktion überprüfen zu können. Die Barrierefunktion wurde durch Vermessung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) analysiert. Der Epithellayer wurde auf verschiedene Komponenten der Tight Junctions (TJs) immungefärbt und konfokalmikroskopisch hinsichtlich der Lokalisation von TJ-Proteinen (Occludin und ZO-1) untersucht. Darüber hinaus wurden Monozyten auf ihre Zytokinproduktion und die Expression von Oberflächenmarkern durchflusszytometrisch (FACS) vermessen. In den genannten Co-Kulturexperimenten ergab sich im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe ein erheblicher TER-Abfall der IEC-Layer bei Exposition mit CD14- positiven Monozyten, die von Zöliakie-Erkrankten isoliert wurden. Darmepithelzellen, die ausschließlich mit IL15/Tglia behandelt worden waren und unbehandelte Zellen zeigten keine Abnahme des TERs. Desweiteren wurden eine Abnahme der Occludin-Expression sowie eine abnormale ZO-1-Junktion nach Co-Kultivierung der Darmepithelzellen mit Zöliakie-Monozyten beobachtet. Die Bestimmung der Zytokinkonzentrationen in Monozyten-Überständen zeigte eine höhere Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen, insbesondere Interleukin-6 und MCP-1. Die Expressionsanalyse der Oberflächenmarker ergab keine signifikanten Veränderungen bei Zöliakie-Monozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zusammengefasst ergab sich, dass periphere CeD-Monozyten eine pro-inflammatorisches Zytokin-Signatur aufweisen, die dazu beitragen kann, die epitheliale Barrierefunktion von IEC durch Veränderung der TJ-Proteinkomposition zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Studie untersuchten wir den Einfluss von Interleukin-22 (IL-22) auf die epitheliale Barrierefunktion und die epitheliale Polarität von IECs. IL-22 bindet an einen hauptsächlich auf IECs exprimierten heterodimeren Transmembranrezeptor. Die Bindung von IL-22 an den IL-22-Rezeptor führt zur Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, insbesondere STAT-3, MAPK und PI3K/AKT. Um die IL-22-spezifische Rolle bei Barrierefunktion und Zellpolarität zu klären, wurden IECs mit unterschiedlichen effektiven Konzentrationen und verschiedenen Expositionszeiten mit IL-22 exponiert. IECs wurden in Matrigel implantiert, wo sie zu 3-dimensionalen Zysten ±IL-22 differenzierten. Dann wurden die Zystenmorphologie/Lumenformation und Polaritätsprotein-Expression mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Transepithelial elektrischer Widerstand (TER) und Calciumswitch- Experimente wurden durchgeführt, um die Barrierefunktion bzw. die TJ-Assemblierung zu untersuchen. Zudem wurde die Expression der TJ- und Zellpolaritätsproteine mittels Western blotting und konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Zellmotilität wurde mittel Migrations- und auch Invasionsassays untersucht. Hinweise für das Vorliegen einer Epithelial-zu- mesenchymalen Transition (EMT) wurden mittels RT-qPCR (RNA) und Western blotting (Protein) untersucht. Die Aktivität verschiedener Signaltransduktionswege wurde in An- und Abwesenheit verschiedener Inhibitoren der STAT3- und MAPK/ERK-Signalwege mittels Phosphoblotting bestimmt. Wir beobachteten, dass IL-22 bei IECs einen reproduzierbaren, Zelllinien-unabhängigen Barrieredefekt verursachte. TJ-Proteinexpression und -lokalisation waren deutlich verändert. Eine verspätete Erholung des TERs sprach im Calcium-switch- Versuch für das Vorhandensein eines IL-22-Effekts auf die TJ-Assemblierung. Bei unserem 3D-Zystenmodell zeigten sich Multilumen bzw. auch aberrante Zysten wie auch eine Fehllokalisation der Zellpolaritätsproteine Par-3 and Dlg-1 nach IL-22-Exposition. Die i.R. der o.g. Experimente nachweisbare, IL-22-induzierte, erhöht gemessene Zellmotilität und auch Zellinvasion brachten wir in Zusammenhang mit der Induktion EMT-typischer Transkriptionsfaktoren (Snail, Slug). Interessanterweise konnte man den Großteil der o.g. Effekte durch Inhibition der MAPK-Kaskade normalisieren. Dahingegen führte die Blockade des STAT3-Signalwegs zur IEC-Apoptose. Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass IL-22 auf die intestinal-epitheliale Barrierefunktion einen vermindernden Effekt, was mutmaßlich auf die gleichzeitig stattfindende Induktion von EMT zurückgeht. Dies verursacht Defekte in der epithelialen Zellpolarität und erhöht die IEC-Motilität. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass IL-22 die TJ-Proteinexpression vermindert und TJ-assoziierte Barrieredefekte über den ERK- Signalweg vermittelt.
