In vitro Untersuchungen Leberregenerations-spezifischer microRNAs in kultivierten Hepatozyten

Abstract

Einleitung

Leberregenerations-assoziierte microRNAs (miRNAs) könnten die Basis für die Entwicklung innovativer Behandlungskonzepte für Patienten mit bestimmten Lebererkrankungen sein. Dabei ist die Stimulierung der Zell-eigenen proliferativen Kapazität der Hepatozyten im Kontext zellbasierter Therapiekonzepte ein möglicher Ansatz. Als Grundlage für die Etablierung derartiger Therapiekonzepte war das Ziel dieses Promotionsvorhabens die in vitro Untersuchung spezifischer miRNAs in Rattenhepatozyten und die Evaluierung ihrer Bedeutung für die Leberregeneration. Es wurde dabei die Hypothese aufgestellt, dass die Depletion bzw. Supplementierung der Leberregenerations-assoziierter miRNAs miR-125b-5p, miR-26a und let-7e in vitro Einfluss auf die posttranskriptionelle Genexpression hat und der resultierende Effekt auf Zellzyklus-assoziierte Zielgene die Leberzellproliferation verstärken kann.

Material und Methoden

Es wurden primäre Rattenhepatozyten in vitro kultiviert und mit Inhibitoren und Mimics der Leberregenerations-assoziierten miRNAs miR-125b-5p, miR-26a und let-7e transfiziert. Die Zellkulturen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet und der Einfluss auf potenzielle Zielgene mittels quantitativer miRNA-RT-PCR, mRNA-RT-PCR, Western Blot und ELISA analysiert.

Ergebnisse

Es konnte gezeigt werden, dass eine in vitro Inhibition und Supplementierung endogener miRNAs in primären Hepatozyten möglich ist. Interessanterweise zeigte sich auf mRNA Ebene eine in Abhängigkeit des jeweils genutzten Housekeeping-Gens überraschend variable Expression der zum Zeitpunkt dieser Untersuchungen putativen Zielgene p53 und CCND2. Während die Ausschaltung (knockdown) bzw. die Überexpression der miR-125-5p, gemittelt auf Beta-2-Microglobulin, zu einem der Hypothese entsprechenden Anstieg bzw. Abfall des endogenen p53 mRNA Levels führte, zeigten die Ergebnisse, gemittelt auf Beta Actin, ausschließlich eine Expressionssteigerung. Auf Protein-Ebene war keine eindeutige Regulation beider Zielgene durch den miRNA-Eingriff erkennbar.

Diskussion

Zusammengefasst konnte durch den hier angewandten, artifiziellen Eingriff in den Regulationskreislauf der Regenerations-assoziierten microRNAs miR-125b-5p, miR-26a und let-7e kein eindeutiger Effekt auf die vermuteten Zielgene p53 und CCND2 in Rattenhepatozyten erzielt werden. Ein möglicher Erklärungsansatz für dieses Ergebnis könnte die in der Literatur beschriebene speziesabhängige Expression und Variabilität der untersuchten Zielgene darstellen. Auch eine direkte Beeinflussung von Housekeeping-Genen durch die ausgewählten miRNAs wäre denkbar. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um zu überprüfen, ob mittels eines Eingriffs in den microRNA-Haushalt der Leberzelle eine gezielte Stimulierung der Proliferation als Grundlage für einen zukünftigen therapeutischen Ansatz erzielt werden kann.

Introduction Regeneration-associated MicroRNAs (miRNAs) might serve as a promising basis for the development of innovative treatment concepts for patients with severe hepatic diseases. In particular, liver regeneration research is focused on the stimulation of the proliferative capacity of the liver, since cell-based therapy concepts for the liver depend on a specific proliferation stimulus. The aim of this study was to determine whether depletion or supplementation of specific liver regeneration-associated miRNAs miR-125b-5p, miR-26a and let-7e may influence the post-transcriptional expression of cell cycle associated target genes in vitro, thus finally leading to an increase of liver cell proliferation. Material and Methods For this purpose, primary rat hepatocytes were cultured and transfected with inhibitors and mimics of the liver regeneration related miRNAs miR-125b-5p, miR-26a and let-7e. The cell cultures were harvested at different time points and the impact of the knockdown or supplementation on regeneration related target genes was analyzed by miRNA-RT-PCR, mRNA-RT-PCR, Western blot and ELISA. Results The study confirmed that inhibition and supplementation of endogenous miRNAs in primary hepatocytes is technically feasible. However, on mRNA level, a surprisingly variable expression of the putative targets P53 and CCND2 was observed, depending on the respective housekeeping genes used in the analysis. While the knockdown and overexpression of the miR-125-5p, when calculated on beta-2-microglobulin, resulted in a hypothesis corresponding increase or decrease of the endogenous p53 mRNA level, the results computed on the basis of beta actin, only showed an increase of gene expression. At the protein level, no definite conclusion regarding the regulation of both targets could be drawn. Discussion In summary, the artificial intervention in the regulatory cycle of the liver regeneration associated microRNAs 125b-5p, miR-26a and let-7e did not show a significant influence on the suspected target genes p53 and CCND2 in rat hepatocytes. A possible explanation for this result could be the species-dependent expression and variability of the target genes also described in the literature. Moreover, a direct impact of the selected miRNAs on housekeeping genes is conceivable. Further studies are needed to determine whether a targeted stimulation of proliferation as a basis for future therapeutic approaches can be achieved by intervention in microRNA processes of the liver cells.