Elucidating the mechanisms of bone regeneration using longitudinal intravital multiphoton endomicroscopy in the murine bone marrow

Abstract

Bone regeneration is a complex process that involves the interaction between cells of the vascular network, the immune system, and mesenchymal cells. The underlying mechanisms and dynamics are not fully understood. To allow a visual analysis of these mechanisms during regeneration and over time, a system for longitudinal intravital multiphoton microendoscopy of the murine bone (LIMB) was developed. This dissertation aims to 1) describe the immunophysiological reaction to the LIMB system, 2) to adapt the system for longitudinal microendoscopy in osteotomies (Limbostomy), and 3) to elucidate the role of mononuclear phagocytes in the process of angiogenesis during healing. The implantation of the LIMB system resulted in a transient immunophysiological reaction accompanied by the expression of the extracellular matrix marker Laminin, an accumulation of CD45+ lymphocytes, and the presence of CD31hiEmcnhi (type H) endothelium at the site of injury. All reactions cleared after 28 days without impairment of bone vessel perfusion or hematopoiesis. Longitudinal analysis of vasculature using vascular fluorescent dye revealed vascular plasticity in the bone marrow during homeostasis. A modular design of the LIMB system for longitudinal intravital microendoscopy of murine osteotomies, termed Limbostomy, was developed. It is specified by an improved field of view and image quality, as well as adaptability of the endoscope tissue penetration depth. Using transgenic fluorescent reporter mice for the endothelial cell promotor Cadherin, two phases of vascularization were observed after osteotomy. In the first phase, neovascularization started between day 3 and 4 post-osteotomy and was completed within 24 hours. Activated endothelial cells that penetrated the initial fracture hematoma were derived from an existing vascular network. In the second phase, the endothelial network continuously remodeled, while the bony callus was built and restructured. Using immunofluorescent histology, type H endothelium was found to be the predominant vasculature and co-localized with F4/80hi macrophages during healing. In the osteotomy gap, the majority of cells seven days post-osteotomy were CX3CR1+Gr1-F4/80+ macrophages. Using Limbostomy, the increase of CX3CR1+ cells was observed to be initiated 2 – 3 days post-osteotomy. CX3CR1+ cells preceded vascularization and were present throughout the regeneration process. In summary, LIMB reveals vascular dynamics during homeostasis. In addition, the new LIMB approach was further developed to visualize spatiotemporal organization during bone regeneration. The findings imply that niches in the bone marrow are subject to continued tissue changes and that CX3CR1+ mononuclear phagocytes play a role in promoting vascularization and endothelial remodeling.

Die Knochenregeneration ist ein komplexer Prozess mit enger Interaktion von Zellen des Gefäßnetzes, des Immunsystems und mesenchymaler Zellen. Die dem Prozess zugrundeliegenden Mechanismen und die Dynamiken sind noch nicht vollständig verstanden. Methoden, die die Analyse dieser Mechanismen während der Heilung und über die Zeit visualisieren, sind nicht verfügbar. Daher wird ein System für longitudinale intravitale Multi-Photonen-Mikroendoskopie des murinen Knochens (longitudinal intravital multiphoton endomicroscopy in the murine bone marrow, LIMB) entwickelt. Diese Arbeit zielt darauf ab, 1) die immunologische Reaktion auf das LIMB-System zu beschreiben, 2) das System für die longitudinale Mikroendoskopie bei Osteotomien (Limbostomy) anzupassen und 3) die Rolle mononukleärer Phagozyten im Prozess der Angiogenese während der Heilung aufzuklären. Die Implantation des LIMB-Systems führte zu einer transienten immunphysiologischen Reaktion, die von der Expression des extrazellulären Matrixmarkers Laminin, einer Akkumulation von CD45+ Lymphozyten und der Anwesenheit von CD31hiEmcnhi (Typ H) Endothel am Ort der Knochenverletzung begleitet wurde. Alle Reaktionen verschwanden nach 28 Tagen, ohne bleibende Beeinträchtigung der Knochengefäßperfusion oder Hämatopoese. Die Analyse des Gefäßsystems mit Hilfe eines vaskulären Fluoreszenzfarbstoffs zeigte vaskuläre Plastizität im Knochenmark während der Homöostase über die Zeit. Ein adaptiertes LIMB-System mit modularem Design, Limbostomie benannt, wurde mit verbessertem Sichtfeld und Bildqualität, sowie Anpassungsfähigkeit in der Eindringtiefe des Endoskops entwickelt. Mit transgenen Fluoreszenz-Reportermäusen unter dem Endothelzellpromotor Cadherin wurden nach der Osteotomie zwei Phasen der Vaskularisierung beobachtet. Eine initiale Neovaskularisierung, die zwischen Tag 3 und 4 nach der Osteotomie einsetzt und innerhalb von 24 h abgeschlossen war. Aktivierte Endothelzellen, die in das initiale Frakturhämatom eindrangen, stammten aus dem bestehenden Gefäßnetz. Das Endothelnetzwerk wurde in einer zweiten Phase kontinuierlich umgestaltet, während Knochenkallus auf- und umgebaut wurde. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Histologie wurde festgestellt, dass das vorherrschende Gefäßsystem einen Typ-H Endothelphänotyp aufweiste und während der Heilung mit F4/80hi Makrophagen kolokalisierte. Am siebten Tag nach der Osteotomie waren die meisten Zellen in dem Osteotomiespalt CX3CR1+Gr1-F4/80+ Makrophagen. Mit der Limbostomie-Methode wurde beobachtet, dass die Zunahme der CX3CR1+ Zellen 2 – 3 Tage nach der Osteotomie einsetzte. CX3CR1+ Zellen gingen der Vaskularisierung voraus und waren während des gesamten Regenerationsprozesses vorhanden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die LIMB-Methode vaskuläre Plastizität während der Homöostase offenbarte. Außerdem wurde hier der neue, technische Ansatz der LIMB-Methode erweitert, um die Visualisierung der räumlichen und zeitlichen Organisation während der Knochenregeneration zu ermöglichen. Die Ergebnisse implizieren, dass Nischen im Knochenmark kontinuierlichen Gewebeveränderungen unterworfen sind und dass mononukleäre CX3CR1+ Phagozyten an der Vaskularisierung und dem Umbau des Gefäßnetzwerks beteiligt sind.