Effect of probiotic supernatants on the metabolic activity and survival of Streptococcus mutans in vitro

Abstract

Abstract Background Dental caries is associated with a disturbance in the dynamic balance of oral microbial homeostasis, which leads to the community dominance of acidogenic and acid-tolerating species like Streptococcus mutans. Streptococcus oligofermentans and Limosilactobacillus reuteri have been shown to inhibit the metabolic activity and survival of S. mutans, which may exert antibacterial effects through the release of substances like hydrogen peroxide, reuterin, ammonia, and organic acids. This study aimed to investigate the environment-specific mechanisms of metabolic activity and survival inhibition by S. oligofermentans and L. reuteri against S. mutans. Methods L.reuteri and S.oligofermentans were cultivated in different environments: minimal medium (MM), minimal medium containing glucose (MM+Glu), glycerol (MM+Gly), lactic acid (MM+Lac), arginine (MM+Arg), and all four substances (MM+all) in vitro. After incubation, culture supernatants were obtained and metabolite contents (hydrogen peroxide, reuterin, ammonia, lactate) measured by colorimetric assays. S.mutans was similarly cultured in the above six various MM variations and glucose was additionally added to the MM+Gly, MM+Lac, and MM+Arg group (control samples), as well as the described probiotic supernatants of these groups (test samples). The lactate concentration produced by S.mutans was detected and its survival (as colony-forming units/mL) evaluated. One-way ANOVA followed by Dunnett’s test was used for statistical comparison (p=0.05). Results L. reuteri and S. oligofermentans environment-specifically generated hydrogen peroxide, reuterin, ammonia, and lactate. When S.mutans was cultivated in S. oligofermentans supernatants, its lactate yield was significantly reduced (p<0.01), especially in MM+Lac+Glu and MM+all. There was no detectable lactate yield compared to the control samples. The mean (SD) for the control samples were 4.46 (0.41) mM and 6.00 (0.29) mM, respectively (p<0.001). When cultivated in L. reuteri supernatants, all groups except MM+Lac+Glu showed a similar reduction in lactate yield (p<0.01). For S. mutans, when cultivated in the supernatants of S. oligofermentans in MM+Lac+Glu and MM+all, its survival was significantly reduced by 0.6-log10 and 0.5-log10, respectively. Cultivation with the supernatant of L. reuteri caused the survivability of S. mutans in MM+Gly+Glu and MM+all reduced by 6.1-log10 and 7.1-log10, respectively. Conclusions The cultivation of S. mutans in the supernatants containing probiotic products may have an inhibitory effect on its metabolic activity and survival, and this effect was environment-specific through different pathways.

Zusammenfassung Hintergrund Zahnkaries ist mit einer Störung des dynamischen Gleichgewichts der oralen mikrobiellen Homöostase verbunden, die zur Dominanz von azidogenen und azidurischen Spezies wie Streptococcus mutans führt. Probiotika wie Streptococcus oligofermentans und Limosilactobacillus reuteri können die Stoffwechselaktivität und das Überleben von S. mutans hemmen, u.a. durch die Freisetzung von Substanzen wie Wasserstoffperoxid, Reuterin, Ammoniak und organischen Säuren. Ziel dieser Studie war es, die umgebungsspezifischen Mechanismen, mit denen S. oligofermentans und L. reuteri die Stoffwechselaktivität und das Überleben von S. mutans beeinflussen, zu untersuchen. Methoden L. reuteri und S. oligofermentans wurden unter verschiedenen Umgebungsbedingungen kultiviert; Minimalmedium (MM), MM mit einem Glukosezusatz (MM+Glu), Glycerinzusatz (MM+Gly), Milchsäurezusatz (MM+Lac), Argininzusatz (MM+Arg) und Zusatz aller vier Substanzen (MM+all). Nach der Inkubation wurden der Metabolitengehalt (Wasserstoffperoxid, Reuterin, Ammoniak, Lactat) in den Kulturüberständen durch kolorimetrische Assays bestimmt. S. mutans wurde in ähnlicher Weise in den obigen sechs verschiedenen MM-Variationen kultiviert, wobei ein Zusatz von probiotischen Kulturüberständen erfolgte (Testgruppen) oder nicht erfolgte (Kontrollgruppen). Die von S. mutans produzierte Laktatmenge wurde bestimmt und das Überleben von S. mutans (koloniebildende Einheiten/mL) bewertet. Eine Einwege-ANOVA gefolgt von einem Dunnett-Test wurde zum statistischen Vergleich verwendet (p = 0.05). Ergebnisse L. reuteri und S. oligofermentans erzeugten umgebungsspezifisch Wasserstoffperoxid, Reuterin, Ammoniak und Laktat. Wenn S. mutans in S. oligofermentans-Überständen kultiviert wurde, war seine Laktatausbeute signifikant verringert (p<0.01). In MM+Lac+Glu und MM+all war in den Testgruppen keinerlei Laktatnachweis mehr möglich; in den Kontrollgruppen betrug die durchschnittliche Laktatmenge hier 4.46 mM (Standardabweichung 0.41) und 6.00 mM (Standardabweichung 0.29) (p<0.001). Bei Kultivierung in L. reuteri-Überständen zeigten alle Gruppen außer MM+Lac+Glu eine ähnliche Verringerung der Laktatausbeute (p<0.01). Das Überleben von S. mutans war bei Kultivierung in den Überständen von S. oligofermentans in MM+Lac+Glu und MM+all um 0.6-log10 und 0.5-log10 signifikant verringert. Die Kultivierung mit dem Überstand von L. reuteri in MM+Gly+Glu und MM+all reduzierte die S. mutans-Zahl um 6.1-log10 und 7.1-log10. Schlussfolgerungen Die Stoffwechselaktivität und das Überleben von S. mutans waren signifikant verringert, wenn sie probiotischen Überständen ausgesetzt wurden, wobei umgebungsspezifisch verschiedene Effektpfade eingesetzt wurden.