Enzyme-Responsive DOTA-Based Optical Probes

Abstract

Small-molecule optical probes have proven to be valuable tools for research and preclinical applications and are successively being incorporated into clinical practice as indispensable sensitive imaging diagnostics that allow for the non-invasive real-time monitoring of pathological alterations on a molecular level. The present work deals with the development, characterization, and application of novel enzyme-activatable optical probes based on the DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid) scaffold as central, multifunctionalizable and highly flexible template. Within the first project of this work, the development of a sophisticated dual functional DOTAM-based fluorescent probe for cancer imaging is presented, combining favorable features of a targeted probe and a substrate-based probe. The probe comprises the DOTAM-scaffold as inherent structural motif of a cathepsin S activatable internally quenched fluorescent (IQF) substrate, as well as cRGDfK peptidic ligands that preferentially bind to ανβ3 integrins, thus combining recognition motifs for two highly relevant and specific cancer targets. Biochemical profiling revealed that the probe and a non-targeted control analogue feature excellent in vitro activation kinetics towards cathepsin S exhibiting site-specific cleavage of the sequence, and that they are stable in presence of a series of common intracellular bioanalytes. Comparison to the non-targeted control probe revealed significantly better staining intensity of cancer cells for the dual functional probe, which correlated with the extent of ανβ3 receptors on the different cell lines. Moreover, staining was significantly impaired upon preincubation with cRGDfK peptide or the cysteine protease inhibitor E64d, implying integrin-mediated uptake and cathepsin-mediated activation of the targeted cathepsin S probe in cancer cells. In contrast, application in a healthy cell line resulted in negligible fluorescence intensities, suggesting high overall selectivity of the probe for cancer cells and demonstrating the potential of the presented DOTAM-based dual functionality approach for future probe design. The second part of this work describes the development of a DOTA-based lanthanide luminescent nitroreductase (NTR) activatable probe. NTR, an enzyme that is capable of reducing aromatic nitro groups to their corresponding amines, is almost exclusively found in bacteria and thus constitutes an attractive target for bacterial imaging applications. The probe is activated through NTR-mediated formation of a carbostyril sensitizing antenna proceeding from a conceptually novel silent caged carbostyril precursor, by which subsequently energy transfer to a DOTA-chelated terbium ion is facilitated. This results in a large signal increase through long-lived lanthanide-centered luminescence allowing for time-gated detection of NTR activity. We could demonstrate that the probe is selectively activated by NTR while remaining essentially non-emissive in presence of other reductive and oxidative bioanalytes. Additionally, the probe not only enabled the detection of NTR in bacterial lysates but was also capable of tracing NTR activity in live bacteria of the ESKAPE family, a group of clinically highly relevant pathogens often developing multidrug resistance responsible for the majority of nosocomial infections. The probe system further features a favorable accumulation behavior: while the inactivated precursor is readily taken up by bacterial cells, the activated probe is not able to enter these, conversely suggesting intracellular entrapment. The presented work thus constitutes the first example to enable detection of bacterial NTR activity with lanthanide luminescent probes and, moreover, the first example to demonstrate fluorescence lifetime imaging of enzymatic activity in live cells with this type of probes.

Molekulare optische Sonden sind wertvolle Werkzeuge für Forschung und präklinische Anwendungen und werden zunehmend in die klinische Praxis als sensitive bildgebende Diagnostika integriert, um die nichtinvasive Echtzeitüberwachung pathologischer Abweichungen auf der molekularen Ebene ermöglichen. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung neuartiger enzymaktivierbarer molekularer Sonden basierend auf dem DOTA-Gerüst (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäureamid) als zentrales, multifunktionalisierbares und hochflexibles Templat. Das erste Projekt der Arbeit befasst sich mit der Entwicklung komplexer doppelt funktionaler DOTAM-basierter fluoreszenter Sonden für die Erkennung von Krebs, welche vorteilhafte Eigenschaften von zielgerichteten und substratbasierten Sonden vereint. Die Sonde beinhaltet das DOTAM-Gerüst als inhärentes strukturelles Motiv einer Cathepsin S-aktivierbaren FRET-Sequenz sowie cRGDfK-Peptidliganden, welche bevorzugt an ανβ3-Integrine binden, und kombiniert hierdurch Erkennungsmotive für zwei hochrelevante und spezifische Krebstargets. Es konnte gezeigt werden, dass die Sonde und ein nicht-zielgerichtetes Kontrollanalog exzellente in vitro Aktivierungskinetiken aufweisen und regiospezifisch durch Cathepsin S gespalten werden, und dass sie unempfindlich gegenüber einer Reihe intrazellulärer Bioanalyten sind. Der Vergleich zur nicht-zielgerichteten Kontrolle ergab eine signifikant verbesserte Markierungseffizienz von Krebszellen für die doppelt funktionale Sonde, welche mit der Anzahl an ανβ3-Rezeptoren auf den verschiedenen Zelllinien korrelierte. Darüber hinaus wurde die Aktivierung der Sonde stark sowohl durch Präinkubation mit cRGDfK Peptid als auch dem Cysteinprotease-Inhibitor E64d abgeschwächt. Dies lässt auf Integrin-vermittelte Aufnahme und Cathepsin-vermittelte Aktivierung der Sonde in Krebszellen schließen. In einer gesunden Zelllinie wurden hingegen vernachlässigbare Fluoreszenzintensitäten beobachtet, was auf eine hohe übergreifende Selektivität der Sonde für Krebszellen hindeutet und das Potential des vorgestellten Ansatzes DOTAM-basierter doppelt funktionaler Sonden demonstriert. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Entwicklung einer aktivierbaren DOTAM-basierten Lanthanoid-lumineszenzsonde für Nitroreduktase (NTR). NTR ist ein Enzym, das in der Lage ist, aromatische Nitrogruppen zu den entsprechenden Aminen zu reduzieren. Da es fast ausschließlich in Bakterien vorkommt, stellt es ein attraktives Target für Anwendungen bakterieller Bildgebung dar. Ausgehend von einem neuartigen stillen Carbostyril-Vorläufer wird die Sonde durch die NTR-vermittelte Bildung einer sensibilisierenden Carbostyril-Antenne aktiviert. Dies ermöglicht Energietransfer zu einem DOTA-komplexierten Terbiumion. Dies resultiert in einer starken Signalzunahme durch langlebige, Lanthanoid-zentrierte Lumineszenz, welche die zeitgesteuerte Detektion von NTR-Aktivität erlaubt. Es konnte gezeigt werden, dass die Sonde selektiv durch NTR aktiviert wird, während sie in Gegenwart anderer reduktiver und oxidativer Bioanalyten still bleibt. Weiterhin ermöglicht die Sonde nicht nur die Detektion von NTR in bakteriellen Lysaten, sondern ist ebenfalls in der Lage, das Enzym in lebenden Bakterien der ESKAPE-Familie nachzuweisen, eine Gruppe klinisch hochrelevanter Krankheitserreger welche oft Multiresistenzen ausbilden und für den Großteil der Krankenhausinfektionen verantwortlich sind. Das Sondensystem weist zusätzlich ein vorteilhaftes Akkumulationsverhalten auf: während der inaktive Vorläufer schnell von Bakterienzellen aufgenommen wird, ist die aktivierte Sonde nicht in der Lage in diese zu permeieren, was darauf hindeutet, dass sie intrazellulär eingeschlossen und angereichert wird. Die vorliegende Arbeit stellt das erste Beispiel von Lanthanoid-Lumineszenzsonden zum Nachweis bakterieller NTR-Aktivität dar und beinhaltet darüber hinaus die erste Anwendung von Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie zur Bildgebung enzymatischer Aktivität in lebenden Zellen mit Lanthanoid-Lumineszenzsonden.