Charakterisierung von iRhom2-defizienten Makrophagen unter atherogenen Stimuli

Abstract

Hintergrund: Die Atherosklerose stellt eine entzündliche, Makrophagen-dominierte Gefäßerkrankung dar und ist weltweit für die meisten Todesfälle verantwortlich. Makrophagen sezernieren den Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), welcher zunächst als Vorläuferprotein an der Zellmembran vorliegt und durch das TNF-α Converting Enzyme (TACE) in eine bioaktive, lösliche TNF-α Form gespalten wird. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass TACE für diesen Prozess auf das inaktive Rhomboid-Protein 2 (iRhom2) angewiesen ist. Ziel: Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von iRhom2-defizienten Makrophagen unter atherogenen Stimuli. Methoden: Für die Versuche wurden bone marrow derived macrophages (BMDM) aus iRhom2+/+ und iRhom2-/- Mäusen generiert und mit diversen Stimuli (Lipopolysaccharid = LPS, Interferon-γ = IFN-γ oder Wasserstoffperoxid = H2O2) behandelt. Es erfolgte die Messung der Expression von iRhom2, TACE und TNF-α. Zudem wurde die Expression der für den reversen Cholesterintransport verantwortlichen Transporter quantifiziert. Die BMDM wurden zu M1 und M2 Makrophagen polarisiert und M1 und M2 Marker bestimmt. Die Zellviabilität wurde unter oxidativem Stress zwischen den beiden Genotypen verglichen. Ergebnisse: Die Stimulation mit LPS, IFN-γ und H2O2 bewirkte jeweils die Induktion der Boten-Ribonukleinsäure (mRNA)-Expression von iRhom2 in iRhom2+/+ Makrophagen und von TNF-α in beiden Genotypen. Es zeigte sich in iRhom2-defizienten BMDM ein geringerer Gehalt von TNF-α im Zellüberstand nach der Stimulation mit LPS, IFN-γ oder H2O2. In der mRNA-Expression der für den reversen Cholesterintransport verantwortlichen Transporter wurden keine Unterschiede zwischen iRhom2+/+ und iRhom2-/- Makrophagen festgestellt. Die iRhom2-defizienten Makrophagen und iRhom2-suffizienten Makrophagen unterschieden sich nicht in der mRNA-Expression typischer M1 und M2 Marker nach Polarisierung. Ein signifikanter Unterschied zeigte sich in der Expression des M1 Marker TNF-α. Die Expression und Sekretion von antiinflammatorischem Interleukin-10 (IL-10) war in iRhom2-/- Makrophagen nach deren Aktivierung mit LPS und IFN-γ im Vergleich zu den Wildtyp-Makrophagen erhöht. Die Viabilität der BMDM beider Genotypen nahm unter Behandlung mit H2O2 in gleichen Maßen ab. Diskussion: iRhom2 wird durch inflammatorische Reize induziert und kann somit die inflammatorische Reaktion verstärken. Eine verminderte TNF-α Freisetzung von iRhom2-defizienten Makrophagen könnte im Milieu der atherosklerotischen Plaque einen geringeren inflammatorischen Status bedeuten und durch eine verminderte TNF-alpha-induzierte Apoptose und Induktion von Adhäsionsmolekülen atheroprotektiv wirken. iRhom2-defiziente Makrophagen können in M1 und M2 Makrophagen polarisiert werden und zeigen dabei eine vermehrte IL-10 Sekretion, die sich aufgrund der antiinflammatorischen Eigenschaften von IL-10 ebenfalls atheroprotektiv auswirken könnte.

Atherosclerosis is an inflammatory and macrophage dominated vascular disease and is the main cause of death worldwide. Macrophages secrete tumor necrosis factor-α (TNF-α). TNF-α converting enzyme (TACE) is responsible for cleavage of the membrane-bound precursor TNF-α protein to soluble TNF-α. Maturation of TACE depends on recently discovered inactive rhomboid protein 2 (iRhom2). Objective: The aim of this study is the phenotypic and functional characterization of iRhom2-deficient macrophages under atherogenic stimuli. Methods: Bone marrow derived macrophages were generated from iRhom2+/+ and iRhom2-/- mice and treated with different stimuli (lipopolysaccharide = LPS, interferon-γ = IFN-γ or hydrogen peroxide = H2O2). Gene expression of iRhom2, TACE and TNF-α was measured. Furthermore, gene expression of transporters involved in reverse cholesterol transport was quantified. BMDM polarization towards M1 and M2 macrophages was induced and M1 and M2 markers were measured. Cell viability under oxidative stress was determined. Results: Stimulation with LPS, IFN-γ and H2O2 induced iRhom2 in iRhom2+/+ macrophages and TNF-α in both genotypes. iRhom2-deficient BMDM secreted lower levels of TNF-α protein in response to stimulation with IFN-γ or H2O2. There was no difference in expression of transporters involved in reverse cholesterol transport between iRhom2+/+ and iRhom2-/- macrophages. BMDM polarization led to expression of M1 and M2 marker proteins in iRhom2+/+ and iRhom2-/- macrophages. iRhom2-deficient macrophages exhibited significantly lower expression of M1 marker protein TNF-α. Gene expression and secretion of anti-inflammatory interleukin-10 (IL-10) was higher in iRhom2-/- macrophages after activation compared to iRhom2+/+ macrophages. Cell viability was not different between both genotypes after treatment with H2O2. Discussion: iRhom2 is induced by inflammatory stimuli and may amplify inflammatory processes. Diminished secretion of TNF-α in iRhom2-deficient macrophages may lead to a lower inflammatory status in atherosclerotic plaques. After polarization Rhom2-deficient macrophages showed an increased secretion of anti-inflammatory IL-10, which is atheroprotective.