Electron paramagnetic resonance spectroscopy as method for investigating the redox status in inflammatory skin

Abstract

The redox status describes the balance between oxidants and antioxidants and is essential for maintaining physiological processes. However, excessive radical production can lead to an imbalance, known as oxidative stress, which is involved in a variety of pathological changes associated with cancer or chronic inflammatory skin diseases. However, the role of oxidative stress in atopic dermatitis (AD) has not been elucidated so far and studies on the redox status in atopic skin are very limited. Since inflammatory reactions are associated with oxidative stress and the skin is constantly exposed to environmental factors, oxidative stress could play a role in atopic skin. Here, electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy offers the opportunity to get a comprehensive overview of the redox status in atopic skin and a deeper understanding of this topic. Therefore, different EPR-based approaches using redox active spin probes and a spin trap were established in different ex vivo and in vitro skin models to assess both the oxidative and antioxidative status in the skin. In the investigation of the oxidative status, the spin probe PCA was used to quantify the radical production and the spin trap DMPO was used to characterize the radical types. In addition, UVB-NIR radiation was used as an exogenous stress factor to investigate radiation-induced radical production in the skin and thus gaining information about the stress resistance. Furthermore, the spin probe TEMPO was used to investigate the antioxidative status, which gives information on the antioxidant capacity in the skin. The established EPR measurements showed differences in the redox status between the different skin models (ex vivo human, porcine, murine skin, in vitro skin equivalent), especially in the amount and type of radicals after UVB-NIR irradiation. Apart from the antioxidant capacity, TEMPO can also be used to obtain spatially resolved information of skin, since it can be distributed in both hydrophilic and lipophilic microenvironments. TEMPO showed a correlation of the distribution into the lipophilic microenvironment with the thickness of the stratum corneum (SC) in different ex vivo and in vitro skin models. Thus, the TEMPO amount in the lipophilic microenvironment directly corresponds to the SC, demonstrating the use of TEMPO to not only provide information on the antioxidant capacity in the whole skin, but also in the lipophilic SC and hydrophilic viable skin. The EPR-based approaches have been successfully established and therefore used to comprehensively investigate the redox status in atopic skin. For this purpose, normal and inflammatory in vitro skin equivalents emulating characteristics of AD were used, which are not influenced by exogenous stress factors and showed a comparable stress resistance to in vivo. The investigations showed a significantly increased metabolic radical production in the inflammatory skin equivalents, which could be due to an increased expression of dual oxidase 1 (DUOX1) in the keratinocytes by stimulation of interleukin- (IL-) 4 and IL-13. In agreement, the glutathione (GSH) concentration in the epidermis of the inflammatory skin equivalents was reduced, which indicates an increased consumption of antioxidants due to increased radical production. In contrast, the antioxidant capacity in both hydrophilic (viable skin) and lipophilic (SC) microenvironment showed no differences between normal and inflammatory skin equivalents. Furthermore, the radical production after UVB-NIR irradiation as well as the radical types produced also showed no differences between the skin equivalents, which represents a similar stress resistance. These results illustrate that the redox status can differ depending on whether the total status or individual components are investigated. In summary, EPR spectroscopy can be used to determine the oxidative and antioxidative status in the skin by using the spin probes PCA and TEMPO and the spin trap DMPO, which illustrates the potential of EPR spectroscopy in the investigation of oxidative stress in dermatological research. Furthermore, the EPR results showed that an increased metabolic radical production and associated oxidative stress could play a role in atopic skin, thus human in vivo studies in particular should be performed in the future in order to develop potential therapeutic approaches.

Der Redoxstatus beschreibt das Gleichgewicht zwischen Oxidantien und Antioxidantien und ist essentiell für die Erhaltung physiologischer Prozesse. Bei einer übermäßigen Radikalproduktion kann jedoch ein Ungleichgewicht entstehen, das als oxidativer Stress bezeichnet wird und bei einer Vielzahl von pathologischen Veränderungen wie Krebs oder chronisch entzündlichen Hauterkrankungen beteiligt ist. Die Rolle von oxidativem Stress in atopischer Dermatitis (AD) ist jedoch bisher nicht aufgeklärt und Studien zum Redoxstatus in atopischer Haut sind sehr limitiert. Da Entzündungsreaktionen mit oxidativem Stress assoziiert sind und die Haut ständig Umweltfaktoren ausgesetzt ist, könnte oxidativer Stress in atopischer Haut eine Rolle spielen. Hierbei bietet die Elektronen-Spin-Resonanz- (ESR-) Spektroskopie die Möglichkeit, einen umfassenden Überblick über den Redoxstatus in atopischer Haut sowie ein tieferes Verständnis zur Thematik zu erhalten. Daher wurden verschiedene ESR-basierte Ansätze mittels redoxaktiven Spinsonden und einer Spinfalle an verschiedenen ex vivo und in vitro Hautmodellen etabliert, um sowohl den oxidativen als auch antioxidativen Status in der Haut zu erfassen. Zur Untersuchung des oxidativen Status wurde die Spinsonde PCA zur Quantifizierung der Radikalproduktion als auch die Spinfalle DMPO zur Charakterisierung der Radikaltypen verwendet. Zusätzlich wurde UVB-NIR Strahlung als exogener Stressfaktor verwendet, um strahlungsinduzierte Radikalproduktion in der Haut zu untersuchen und somit Aussagen zur Stressresistenz zu erhalten. Weiterhin wurde die Spinsonde TEMPO zur Untersuchung des antioxidativen Status verwendet, womit Aussagen zur antioxidativen Kapazität in der Haut getroffen werden können. Die Etablierungsmessungen zeigten Unterschiede im Redoxstatus zwischen den verschiedenen Hautmodellen (ex vivo Human-, Schwein-, Maushaut, in vitro Hautäquivalent) auf, insbesondere in der Radikalmenge und -art nach UVB-NIR Bestrahlung. Zusätzlich zur antioxidativen Kapazität kann TEMPO ebenfalls genutzt werden, um ortsauflösende Informationen in der Haut zu erhalten, da es sich sowohl in hydrophile als auch lipophile Mikroumgebungen verteilen kann. An verschiedenen ex vivo und in vitro Hautmodellen konnte gezeigt werden, dass die TEMPO Verteilung in der lipophilen Mikroumgebung mit der SC Dicke korreliert. Somit entspricht die TEMPO Menge in der lipophile Mikroumgebung direkt dem SC, weshalb TEMPO nicht nur Informationen zur antioxidativen Kapazität in der gesamten Haut, sondern ebenfalls im lipophilen SC und der hydrophilen viablen Haut liefern kann. Die ESR-basierten Ansätze wurden erfolgreich etabliert und wurden daher verwendet, um den Redoxstatus in atopischer Haut umfassend zu untersuchen. Hierfür wurden normale und entzündliche in vitro Hautäquivalente verwendet, die Charakteristika von AD imitieren, durch keine exogenen Stressfaktoren beeinflusst werden sowie eine vergleichsweise ähnliche Stressresistenz zu in vivo aufweisen. Die Untersuchungen zeigten in den entzündlichen Hautäquivalenten eine deutlich erhöhte metabolische Radikalproduktion, das auf eine erhöhte Expression von der Dualoxidase 1 (DUOX1) in den Keratinozyten durch die Stimulation von Interleukin- (IL-) 4 und IL-13 zurückzuführen sein könnte. In Übereinstimmung dazu war die Glutathion- (GSH-) Konzentration in der Epidermis der entzündlichen Hautäquivalente reduziert, das auf einen erhöhten Verbrauch von Antioxidantien aufgrund der erhöhten Radikalproduktion hinweisen lässt. Im Gegensatz dazu zeigte die antioxidative Kapazität sowohl in hydrophiler (viabler Haut) als auch in lipophiler (SC) Mikroumgebung keine Unterschiede zwischen normalen und entzündlichen Hautäquivalenten. Zudem zeigten die Radikalproduktion nach UVB-NIR Bestrahlung als auch die entstandenen Radikaltypen ebenfalls keine Unterschiede zwischen den Hautäquivalenten, das eine ähnliche Stressresistenz darstellt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass sich der Redoxstatus in Abhängigkeit davon unterscheiden kann, ob der totale Status oder einzelne Komponenten untersucht werden. Zusammenfassend kann die ESR-Spektroskopie unter Verwendung der Spinsonden PCA und TEMPO sowie der Spinfalle DMPO verwendet werden, um den oxidativen und antioxidativen Status in der Haut zu bestimmen, dass das Potential der ESR-Spektroskopie zur Untersuchung von oxidativem Stress in der dermatologischen Forschung verdeutlicht. Zudem zeigten die ESR-Ergebnisse, dass eine erhöhte metabolische Radikalproduktion und damit verbundener oxidativer Stress eine Rolle in atopischer Haut spielen könnte, weshalb zukünftig vor allem humane in vivo Studien durchgeführt werden sollten, um potenzielle Therapiemöglichkeiten entwickeln zu können.