Identification of microRNAs promoting proliferation in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using a functional high-throughput screening

Abstract

In adults, cardiac injury results in loss of cardiomyocytes (CM) and subsequent scar formation with heart failure symptoms. Although novel treatment approaches prolonged life span of patients with heart failure, the damaged myocardium cannot be cured, resulting in an unacceptable high prevalence of patients suffering from heart failure. In the current project, during the last years in the laboratory of Dr. med. P. Jakob/Prof. Dr. med. U. Landmesser, we established a forward microRNA-transfection protocol using a liposome-based approach in human iPSC-cardiomyocytes (iPSC-CMs) that results in a high transfection efficiency. This protocol was successfully transferred to a 384-well format that is suitable for a high-throughput screening. In addition, fluorescent staining protocols for read-out of proliferation markers (5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), phosphorylated histone H3 (pH3)) have been performed and optimized in human iPSC-CMs. In addition, a protocol that mimics hypoxia/reoxygenation in human iPSC-CMs has been established. After the accomplishment of these important milestones, we later transferred the protocol to the Screening Unit at Leibniz-Institute for Molecular Pharmacology (FMP, Campus Berlin-Buch) to conduct a functional high-throughput screening. As a model system, we used human iPSC that were differentiated into cardiomyocytes. Two parallel high-throughput screenings for the identification of pro-proliferative microRNAs (miRNAs) in human cardiomyocytes were performed after individual transfection of 2019 miR-mimics and anti-miRs using a microRNA-library. Surrogate markers of cell proliferation were analyzed by high content imaging. For the first time, we utilized a library of 2019 anti- and mimic-miRNAs to identify miRNAs that exert a central role in the induction of cell-cycle reentry and enhancement of proliferation in human cardiomyocytes. Of note, overexpression of two miRNAs - miR-515-3p und miR519e-3p - resulted in a significant induction of proliferation as assessed using functional and molecular validation methods. As withdrawal of adult human cardiomyocytes from the cell-cycle is the primary reason for inadequate replenishment and thus for heart failure in patients after myocardial injury, the identified miRNAs may represent novel potential therapeutic targets for the treatment of myocardial injury and ischemic cardiomyopathy.

Bei Erwachsenen führt ein Myokardinfarkt zum Untergang von Kardiomyozyten (CM), woraufhin es zu anschließender Narbenbildung mit Symptomen der Herzinsuffizienz kommen kann. Obwohl neue Behandlungsansätze die Lebensdauer von Patienten mit Herzinsuffizienz verlängern, kann bisher der geschädigte, nicht-kontraktile Herzmuskel nicht geheilt werden. Dies führt zu einer inakzeptabel hohen Prävalenz von Patienten mit Herzinsuffizienz. Im vorliegenden Projekt haben wir im Labor von Dr. Jakob/Prof. Landmesser ein Transfektionsprotokoll für microRNAs in humanen induzierbaren pluripotenten Stammzellen (iPSC)-Kardiomyozyten mittels einem Lipid-basierten Ansatz etabliert. Zudem haben wir verschiedene Methoden getestet, um eine Hypoxie und Reoxygenierung in vitro nachzuahmen. Diese Protokolle wurden erfolgreich in einem 384-Well-Format transferiert, welches für ein Hochdurchsatz-Screening geeignet ist. Darüber hinaus wurden fluoreszenzbasierte Färbungen zur Detektion von proliferierenden Kardiomyozyten (5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU), phosphoryliertes Histon H3 (pH3)) in hiPSC-Kardiomyozyten etabliert. Nach Erreichen dieses wichtigen Meilensteins wurde am Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie (FMP, Campus Berlin-Buch) das Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. Als Modellsystem verwendeten wir humane iPSC, die in Kardiomyozyten differenziert wurden. Zwei parallele Hochdurchsatz-Screenings zur Identifizierung pro-proliferativer microRNAs (miRNAs) in humanen Kardiomyozyten wurden umgesetzt. Nach individueller Transfektion von 2019 miR-mimics und anti-miRs mittels einer microRNA-Bibliothek wurden Surrogatmarker der Zellproliferation mittels high-content Imaging analysiert. Die vorliegende Studie hat zum ersten Mal eine Bibliothek aus 2019 anti- und mimic-miRNAs getestet, um microRNAs zu identifizieren, welche eine zentrale Rolle für den Wiedereintritt in den Zellzyklus in humanen iPSC-Kardiomyozyten spielen. Die Überexpression zweier miRNAs – miR-515-3p und miR519e-3p - führte in verschiedenen funktionellen und molekularen Validierungsexperimenten zu einem signifikanten Anstieg der Zell-Proliferation. Da die ausbleibende Zellproliferation der Kardiomyozyten und somit der Verlust des kontraktilen Herzmuskels bei Patienten mit Herzinfarkt die primäre Ursache der Herzinsuffizienz darstellt, bieten die identifizierten microRNAs einen potenziellen Therapieansatz zur Wiederherstellung des Herzmuskels über eine Anregung der proliferativen Signaltransduktionswege in Kardiomyozyten.