Untersuchung der Bedeutung des Vasopressin-2-Rezeptor (V2R) Signaling für die Morphologie und Funktion der dicken aufsteigenden Henle-Schleife (TAL)

Abstract

Das hypophysäre Hormon Vasopressin (AVP) fördert über eine Aktivierung des Vasopressin Typ 2-Rezeptors (V2R) den Konzentrierungsmechanismus des Urins. Die renale Expression des V2R ist im Sammelrohr, darüber hinaus jedoch auch im aufsteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife (TAL) und im distalen Konvolut (DCT) des Nephrons lokalisiert. Mutationen, die das V2R-Gen inaktivieren, können zu Erkrankungen wie dem nephrogenen Diabetes insipidus mit schwerer Einschränkung des Konzentrierungsmechanismus führen. Die Einflüsse von AVP auf die Funktion des distalen Tubulus lassen sich bisher nicht klar von denen auf das Sammelrohr trennen. Meine Arbeit konzentriert sich daher auf die Rolle des V2R-Signalwegs im distalen Nephron mit Bezug auf die hier lokalisierten Na-(K)-Cl Kotransporter. Meine Hypothese war, dass die Wirkung von AVP im distalen Nephron zur Harnkonzentrierung signifikant beiträgt. Für meine Arbeit wurde ein eigener anti-V2R-Antikörper generiert, um die Verteilung des Rezeptors auf zellulärer Ebene entlang des Nephrons optimal zu charakterisieren. Für funktionelle Studien wurde ein transgenes Rattenmodell mit einer selektiven Überexpression einer dominant-negativen V2R-Mutation (Glu242 Stop) im TAL und frühen DCT unter Kontrolle des Promotors für das hier synthetisierte Tamm-Horsfall Protein (THP) generiert. Mit Hilfe des anti-V2R- Antikörpers konnte in TAL, DCT und den Hauptzellen des Sammelrohrs in Rattennieren der V2R membranständig nachgewiesen werden. Die Überexpression des mutierten V2R in den transgenen Ratten konnte ebenfalls immunhistochemisch und im Western blot mit anti-V2R-Antikörper nachgewiesen werden. Im Vergleich zu den Kontrollratten zeigten die transgenen Ratten Polyurie (+25% im Kontrollzustand und +230% im Durstversuch über 18 h; p < 0,05). Die Na-(K)-Kotransporter des distalen Nephrons waren auf transkriptionaler Ebene und auf Protein-Ebene jeweils deutlich reduziert (NKCC2: jeweils -55% und -56%; NCC: jeweils -70% und -38%; p < 0,05). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Unterdrückung des V2R-Signalwegs im TAL und frühen DCT zu einer verringerten Harnkonzentrierungsleistung führt. Sie erbringen weiterhin den Beweis, dass die Stimulierbarkeit des distalen Nephrons durch AVP eine bedeutende Rolle bei der renalen Harnkonzentrierung spielt.

Vasopressin (AVP) promotes urinary concentration by activating type 2 AVP receptor (V2R) in the kidney. Renal expression of V2R is localized in the connecting tubule and collecting duct as the predominant sites of its action. Beyond this, V2R is further localized in the thick ascending limb (TAL) of the loop of Henle and in the distal convoluted tubule (DCT). Mutations, which inactivate the V2R gene, may cause disease such as nephrogenic diabetes insipidus, with massive impairment of the renal concentrating mechanism. However, the effects of AVP on the function of the distal nephron so far could not be distinguished clearly from those on the collecting duct. My work therefore focuses on the role of V2R signaling in the distal nephron. I followed the hypothesis that the effect of AVP in the distal nephron contributes substantially to the process of urine concentration. An anti-V2R antibody was generated to characterize the cellular distribution of the receptor along the nephron. For functional studies a transgenic rat model with selective overexpression of a dominant-negative V2R mutant (Glu242 stop) in TAL and early DCT was generated using the promoter of locally synthesized Tamm-Horsfall protein (THP) for site-directed overexpression. Immunohistochemical analysis using anti-V2R antibody produced basolateral signals in TAL, DCT, and principal CD cells in rat and mouse kidneys. Transgenic overexpression of the mutated V2R in rats was verified morphologically and immunoblotting with the anti-V2R antibody. The construct was expressed only in TAL and initial DCT. Compared to control rats, transgenic rats displayed polyuria (+25% at steady state and +230% under water deprivation for 18 h; p < 0.05). Transcriptional and protein levels of the major distal ion cotransporters were markedly reduced (NKCC2 -55% and -56%, respectively; and NCC -70% and -38%, respectively; p < 0,05). These data indicate that suppression of V2R signalling in TAL and early DCT results in impaired urine concentration. Data therefore demonstrate that stimulation of distal nephron NaCl transport by AVP plays a substantial role in the functioning of the renal concentrating mechanism.