Der Angiotensin-II-Typ 1-Rezeptor (AT1R) ist von zentraler Bedeutung für die Homöostase einer Vielzahl kardiovaskulärer Prozesse. Er gehört zur Gruppe der Klasse A-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und wird durch den natürlichen Liganden Angiotensin II (Ang II) aktiviert. Nach seiner Stimulation werden multiple intrazelluläre Signalwege initiiert, wobei die G-Protein-vermittelte Signaltransduktion vorwiegend durch Gq/11 erfolgt. Neben Ang II wird der AT1R auch durch Bindung funktionell agonistischer Immunglobuline G (AT1R-IgG) an extrazelluläre Epitope aktiviert. Beschrieben wurden AT1R-IgG im Kontext verschiedener obliterativer Pathologien wie der Systemischen Sklerose (SSc), wo sie auch von prognostischer Bedeutung sind. Nach Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dragun, die auf eine besondere Bedeutung des ersten extrazellulären Loops (ECL 1) für die immunvermittelte AT1R-Aktivierung hindeuteten, wurde in der vorliegenden Arbeit die AT1R-IgG vermittelte Rezeptoraktivierung durch spezifische Modifikationen des ECL 1 untersucht. Hierfür wurden drei verschiedene Assays angewandt. Verwendet wurde ein Hefe-GPCR-Aktivierungsassay, in dem die Aktivierung eines einzelnen, humanen GPCR mit dem Hefewachstum korreliert. Zudem wurde mittels eines Luciferase-Reporterassays die G-Proteinaktivität in humanen Endothelzellen untersucht. Schließlich wurde durch ein 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU)-Proliferationsassay die EdU-Inkorporation während der DNA-Synthese humaner Endothelzellen bestimmt. In Hefe-GPCR-Aktivierungsassays war bereits gezeigt worden, dass Ang II und IgG-Isolate von PatientInnen mit SSc und hohen AT1R-IgG-Leveln (AT1R+-IgG) zu einer dosisabhängigen Aktivierung des AT1R führen. Diese Aktivierung wurde in beiden Fällen durch den AT1R-Inhibitor Valsartan inhibiert. Luciferase-Reporterassays bestätigten, dass AT1R+-IgG eine Erhöhung der Gq/11-Proteinaktivität in Endothelzellen induzieren. Das Gi-Protein scheint dagegen nicht an der AT1R+-IgG vermittelten Signaltransduktion beteiligt zu sein. Die immunvermittelte Zunahme der Gq/11-Proteinaktivität konnte durch Substitution der Aminosäuren (AS) 92-97 des ECL 1 gegen Alanin aufgehoben werden. Ein spezifischeres Epitop innerhalb einer der Hälften des ersten ECL des AT1R konnte weder mithilfe des Hefe-GPCR-Aktivierungsassays noch des Luciferase-Reporterassays identifiziert werden. Funktionell zeigte sich in EdU-Proliferationsassays, dass die AT1R+-IgG vermittelte AT1R-Aktivierung eine signifikante Erhöhung der Proliferation von humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) induziert. Die immunvermittelte Endothelzellproliferation schien durch Substitution der AS 92-97 des ECL 1 beeinflussbar. Diese Ergebnisse streichen die besondere Rolle des ersten ECL für die AT1R-Aktivierung durch AT1R-IgG heraus und bieten einen interessanten Ansatzpunkt für dessen Etablierung als therapeutisches Target.
The Angiotensin II type 1 receptor (AT1R) is of crucial importance for the homeostasis of a variety of cardiovascular processes. It belongs to the group of class A G protein-coupled receptors (GPCR) and is activated by the natural ligand Angiotensin II (Ang II). After its stimulation, multiple intracellular signaling pathways are initiated with G-protein mediated signal transduction occurring predominantly through Gq/11. Besides Ang II, AT1R is activated by binding of functional agonistic immunoglobulins G (AT1R-IgG) to extracellular epitopes. AT1R-IgG have been described in the context of various obliterative pathologies such as systemic sclerosis (SSc), in which they are also of prognostic importance. Following preliminary work of the group of Prof. Dragun, which pointed to a special importance of the first extracellular loop (ECL 1) for the immune mediated AT1R activation, the present study investigated AT1R-IgG mediated receptor activation by specific modifications of ECL 1. Three different assays were used for this purpose. A yeast GPCR activation assay was performed in which the activation of a single human GPCR correlates with yeast growth. In addition, G-protein activity in human endothelial cells was investigated via a luciferase reporter assay. Finally, a 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) proliferation assay measured EdU incorporation during DNA synthesis in human endothelial cells. In yeast GPCR activation assays it has already been shown that Ang II and IgG isolated from patients with SSc and high AT1R-IgG levels (AT1R+-IgG) lead to a dose-dependent activation of AT1R. In both cases this activation was inhibited by the AT1R inhibitor valsartan. As shown by the luciferase reporter assays, AT1R+-IgG induced an increase in Gq/11 protein activity in endothelial cells. In contrast, the Gi protein does not appear to be involved in AT1R+-IgG mediated signal transduction. By substituting the amino acids 92-97 of ECL 1 against Alanine, the immune-mediated increase in Gq/11 protein activity was abolished. However, neither the yeast GPCR activation assay nor the luciferase reporter assay was able to identify a more specific epitope within one of the halves of the first ECL of AT1R. Functionally, an EdU proliferation assay showed that AT1R+-IgG-mediated AT1R activation induces a significant increase in the proliferation of human microvascular endothelial cells (HMEC-1). This immune mediated endothelial cell proliferation seems to be influenced by substitution of amino acids 92-97 of ECL 1 against alanine. These results emphasize the importance of the first ECL for AT1R activation by AT1R-IgG and offer an interesting starting point for its establishment as a therapeutic target.
