Charakterisierung der Cytokinin-N-Glucosyltransferase-Gene UGT76C1 und UGT76C2 in Arabidopsis thaliana

Abstract

Das Pflanzenhormon Cytokinin spielt bei vielen physiologischen Vorgängen und Entwicklungsprozessen eine wichtige Rolle. Die Konzentration des aktiven Cytokinins wird im Gewebe unter anderem durch deren Degradation durch Cytokininoxidasen/Dehydrogenasen (CKX), aber auch durch die Konjugation mit Zucker reguliert. Bisher wurden in Arabidopsis nur zwei Glucosyltransferasen, UGT76C1 und UGT76C2, beschrieben, welche die Reaktion der Cytokinin-N-Glucosylierung katalysieren. Die genaue physiologische Bedeutung des Stoffwechselwegs der Cytokinin-N-Glucosylierung ist noch nicht bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Überexpressionslinien 35S:UGT76C1-GFP und 35S:UGT76C2-GFP generiert und charakterisiert. Diese wiesen cytokinindefiziente Phänotypen auf, hatten einen reduzierten Cytokininstatus und waren verglichen mit dem WT Cytokinin-insensitiver. Dabei hatte die Expression von UGT76C2 stärkere Auswirkungen als die von UGT76C1. Die Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei der Cytokinin-N-Glucosylierung um einen inaktivierenden Stoffwechselweg handelt. Einzel-Knockout-Mutanten von UGT76C1 und UGT76C2 zeigten keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen. Dies lässt auf eine funktionale Redundanz der beiden Glucosyltransferasen schließen. Mit Hilfe eines Transposonansatzes sowie des CRISPR/Cas9-Systems wurden Doppelmutanten der gekoppelten Gene UGT76C1 und UGT76C2 hergestellt. Cytokiningehaltsmessungen von Einzel- und Doppel-Knockout-Linien zeigten, dass UGT76C2 die Hauptkomponente der Regulation des aktiven Cytokininpools durch die N-Glucosylierung darstellt. Die vollständige Abwesenheit von Cytokinin-N-Glucosiden in ugt76c1,2-Doppelmutanten belegte erstmals, dass es sich bei UGT76C1 und UGT76C2 um die einzigen Cytokinin-N-Glucosyltransferasen in Arabidopsis handelt. Weiterhin belegten die Cytokininmessungen die hohe Kapazität des Cytokininmetabolismus die Konzentration der aktiven Cytokininbasen anzupassen. Dies konnte auch durch qPCR-Messungen und Cytokinin-Sensitivitätstests bestätigt werden. UGT76C1-GFP und UGT76C2-GFP lokalisierten im Cytosol und im Nukleus, in diesen Kompartimenten erfolgt demnach die Cytokinin-N-Glucosylierung und damit die Inaktivierung der Cytokininbasen. Die Untersuchungen der Expressionsdomänen von UGT76C2 durch die Reporterkonstrukte pUGT76C2:GFP und pUGT76C2:UGT76C2-GFP ergab, dass die Expression durch in der kodierenden Sequenz enthaltene regulatorische Elemente spezifiziert wird. Das translationale Reporterkonstrukt war in spezifischen Domänen des apikalen Spross- und Wurzelmeristems sowie in Wurzel-, Blatt- und Blütenprimordien aktiv. Das Expressionsmuster wurde bereits sehr früh in der Embryogenese angelegt. Die ugt76c1,2-Doppelmutante bildete größere und aktivere Infloreszenzmeristeme als der Wildtyp. Demnach konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Cytokinin-N-Glucosylierung die Meristemaktivität und -größe negativ reguliert. Die erhöhte Meristemaktivität ging mit spezifischen Veränderungen der räumlichen Verteilung des Reporters der Cytokininantwort pTCSn:GFP einher. Außerdem zeigten die Untersuchungen, dass die Cytokinin-N-Glucosylierung an der Regulation des Blattwachstums beteiligt ist. Untersuchungen zur Redundanz der Cytokinin-N-Glucosylierung mit anderen Cytokinin-Inaktivierungsmechanismen zeigten, dass die Cytokinin-N-Glucosylierung und der CKX-vermittelte Cytokininabbau teilweise zwar den gleichen Cytokininpool regulieren, der Abbau der Cytokinine aber den Hauptinaktivierungsweg darstellt. Demnach scheint der Beitrag, den die Cytokinin-N-Glucosylierung zur Regulation der Cytokininhomöostase leistet, kleiner zu sein als bisher angenommen wurde oder nur unter bestimmten physiologischen Umständen zum Tragen zu kommen. Erste Untersuchungen zur Rolle der Cytokinin-N-Glucosylierung bei Salz- und Trockenstress zeigten, dass die Cytokinin-N-Glucosylierung in die Regulation dieser Prozesse involviert ist.

Cytokinins are plant hormones which regulate many aspects of plant growth and development. Cytokinin homeostasis is regulated by different mechanisms, such as the degradation through cytokinin oxidases/dehydrogenases (CKX) or inactivation by metabolic conjugation with sugars. Two enzymes with cytokinin N-glucosyltransferase activity, UGT76C1 and UGT76C2, have been identified so far in Arabidopsis. However, the physiological relevance of the cytokinin-N-glucosylation pathway is not well understood. In this work, lines expressing p35S:UGT76C1-GFP and p35S:UGT76C2-GFP were generated and characterized. These lines displayed cytokinin deficiency phenotypes, as well as a reduced cytokinin status and a reduced cytokinin sensitivity in comparison to wild type plants. The effects of the overexpression of UGT76C2 were more severe than those of the UGT76C1 gene. Hence, the results confirm the proposed role of cytokinin N-glucosylation as an inactivating pathway. Single knockout lines of UGT76C1 and UGT76C2 showed no obvious phenotypic changes, indicating functional redundancy of the two genes. A transposon-based approach as well as the CRISPR/Cas9 system were used to generate double knockout lines of the linked genes UGT76C1 and UGT76C2. Cytokinin measurements of the single and the double knockout lines confirmed the dominant role of UGT76C2 in regulating the pool of active cytokinin bases. In ugt76c1,2 double mutant lines the cytokinin N-glucosides were completely absent, proving for the first time that UGT76C1 and UGT76C2 are the only cytokinin N-glucosyltransferases encoded in Arabidopsis. Furthermore, the results revealed a robust capacity of cytokinin metabolism to maintain the concentrations of active cytokinin bases. This was confirmed by qPCR analyses and cytokinin response assays. Further analyses showed that UG76C1-GFP and UGT76C2-GFP were localized in the cytosol and nucleus, suggesting that the cytokinin N-glucosylation pathway operates mainly in these compartments. Analysis of the expression patterns of the reporter constructs pUGT76C2:GFP and pUGT76C2:UGT76C2-GFP revealed that the expression of UGT76C2 is influenced by regulatory elements within the coding sequence. The translational reporter was active in specific domains of the shoot and root apical meristems as well as in root, leaf and flower primordia. The expression patterns were established already early during embryogenesis. The inflorescence meristem of the ugt76c1,2 double mutant was increased in size and activity, indicating a negative impact of cytokinin N-glucosylation on meristem regulation. The enhanced meristem activity was associated with distinct changes in spatial distribution of the cytokinin output sensor pTCSn:GFP. Furthermore, a negative regulatory effect of cytokinin N glucosylation on leaf growth was shown. Analysis of the functional redundancy between cytokinin N-glucosylation and other cytokinin inactivation pathways showed that cytokinin N-glucosylation and CKX-mediated cytokinin breakdown partially regulate the same cytokinin pool, but cytokinin degradation is the predominant inactivation mechanism. Hence, the contribution of the cytokinin N-glucosylation in regulating the homeostasis of cytokinin appears to be less important than anticipated. Alternatively, cytokinin N-glucosylation may come into effect only under specific physiological conditions. In this line, preliminary experiments indicated that cytokinin N-glucosylation is involved in the response to salt and drought stress.