Etablierung eines Expressionssystems in Pichia pastoris zur Herstellung von rekombinanten Fusionsantikörpern am Beispiel des A33rbGFP Fusionsantikörpers

Abstract

Fusionsantikörper sind bifunktionale, rekombinante Moleküle aus einem Antigen- bindenden Antikörperfragment und einem weiteren Molekül, zum Beispiel einem Enzym. Solche Fusionsantikörper werden im Wesentlichen für die Anwendung in der antineoplastischen Chemotherapie konzipiert. In diesem Zusammenhang ist die antikörpergesteuerte Enzym-Prodrug-Therapie (ADEPT) ein zweistufiges Behandlungskonzept, wobei im ersten Schritt der Fusionsantikörper an ein tumor- oder tumorgewebespezifisches Antigen bindet. Im zweiten Schritt wandelt ein mit diesem Antikörper fusioniertes Enzym eine systemisch applizierte, ungiftige Arzneimittelvorstufe (Prodrug) im Tumorgewebe in ein aktives Chemotherapeutikum um, wodurch dessen zytotoxische Wirkung auf den Tumor fokussiert wird. Aufgrund der bisher unbefriedigenden Ergebnisse der Behandlung des kolorektalen Karzinoms stellt die antikörpergesteuerte Enzym- Prodrug-Therapie eine möglicherweise verbesserte adjuvante oder palliative Therapiestrategie dar. Das A33-Antigen wird von 95% der Kolonkarzinome präsentiert und kann genutzt werden, um sowohl Primärtumoren wie Metastasen mit hoher Sensitivität zu detektieren. Es bietet sich damit als Zielantigen einer antikörpergesteuerten Enzym-Prodrug-Therapie an. Um den experimentellen oder klinischen Einsatz von Fusionsantikörpern für ADEPT zu realisieren, sind Expressionssysteme notwendig, die komplexe Proteine in löslicher und funktionaler Form in größerem Maßstab exprimieren können. Mit den vorgestellten Ergebnissen wurde ein solches Expressionssystem zur Herstellung von Fusionsantikörpern in Hefen des Stammes Pichia pastoris etabliert. Dabei wurde beispielhaft der Fusionsantikörper A33rbGFP exprimiert. Er besteht aus dem gegen das A33-Antigen gerichtete A33-Single-Chain-Fragment und einem Green-Fluorescent-Protein (GFP). Das Green-Fluorescent-Protein wurde für dieses Pilotprojekt gewählt, da mit diesem Fusionsprotein einschrittige Fluoreszenzanalysen zum Bindungsverhalten des Fusionsantikörpers durchführbar waren. Das spezifische Bindungsverhalten des Konstrukts an verschiedenen Kolonkarzinomzelllinien konnte vergleichend gezeigt werden. Darüber hinaus wurde versucht, den A33rbCD Fusionsantikörper zu exprimieren, bei dem das Green-Fluorescent-Protein gegen eine bakterielle Cytosindeaminase (CD) als Effektorenzym für ADEPT ausgetauscht wurde. Die Cytosindeaminase katalysiert die Umwandlung der ungiftigen Arzneimittelvorstufe 5?Fluorcytosin in die zytotoxische Wirksubstanz 5-Fluoruracil. Dabei war festzustellen, dass die DNA-Sequenz dieses Fusionsantikörpers in der vorliegenden Form nicht im Hefesystem zu exprimieren war. Es wurde deshalb ein analoges Fusionskonstrukt entworfen und kloniert, in dem anstelle des bakteriellen Enzyms die aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae stammende Cytosindeaminase (CDy) verwendet wird. Auf diese Weise soll eine Expression dieses Fusionsantikörpers für ADEPT in der Hefe Pichia pastoris ermöglicht werden.

Fusion antibodies are recombinant constructs comprising an antigen-binding antibody fragment and an effector molecule such as an enzyme. Such constructs have mainly been designed for use in is antineoplastic therapy. In this context, antibody-directed enzyme-prodrug therapy (ADEPT) is a two-step approach utilizing fusion-antibodies for the tumor-specific activation of inert prodrugs. In the first step, the antibody construct binds to a tumor- specific antigen. Subsequently, the enzyme component of the construct converts a systemically applied, relatively non-toxic prodrug into a cytotoxic metabolite, thus focusing its activity to the tumor tissue. Given the hitherto unsatisfactory outcome of chemotherapy for colorectal carcinoma, ADEPT may provide a means of improved adjuvant or palliative therapy for this cancer. The A33 antigen is expressed on the cell surface in 95% of colon carcinomas and has been utilized to detect both primary and metastatic tumor sites with high sensitivity. Thus, it is a potential target antigen for ADEPT. To realize the experimental or clinical use of fusion antibodies for ADEPT, expression systems are required which can produce in large scale complex proteins in soluble and functional form. The results presented here establish such an expression system for the production of fusion antibodies in the yeast Pichia pastoris, using an A33rbGFP fusion protein as a pilot subject. This fusion protein consisted of a single chain variable region fragment (scFv) directed against the A33 antigen, termed A33rb, and green fluorescent protein (GFP). GFP has been chosen for this pilot project because it allows for one-step fluorescence analysis of fusion protein binding. Specific binding could be demonstrated, comparing various colon carcinoma cell lines quantitatively. In addition, attempts were made to express the fusion construct A33rbCD, which contains the bacterial enzyme cytosine deaminase (CD) instead of GFP. A potential effector enzyme for ADEPT, CD catalyses the conversion of 5-fluorocytosine, which is non-toxic in humans, into the cytotoxic drug 5-fluorouracil. The results of extensive experiments, however, suggested that this fusion construct in the selected form could not be expressed in the yeast system. Therefore we designed and cloned an analogous construct, replacing the bacterial CD enzyme with the isoenzyme from the yeast Sacharomyces cerevisiae (CDy). This new construct is expected to be produced more readily in the yeast expression system.