Non-invasive monitoring of gonadal activity in two carnivores, the spotted hyena (Crocuta crocuta) and the cheetah (Acinonyx jubatus)

Abstract

The development of enzyme immunoassays (EIAs) to measure faecal testosterone metabolites (fTM) facilitates a non-invasive study design to objectify an animal’s gonadal status without taking blood samples. Despite the wide use of these techniques, EIAs need to be carefully validated for each species and hormone. This dissertation was designed to establish and validate EIAs to monitor gonadal activity non-invasively based on faecal hormone analyses in two carnivores, the spotted hyena (Crocuta crocuta) and the cheetah (Acinonyx jubatus). In Article 1, I detail the development and validation of an epiandrosterone EIA for the measurement of fTM in spotted hyenas. We performed radiometabolism studies to characterise fTM excreted in a captive male and female spotted hyena, respectively and demonstrated that the epiandrosterone EIA detected immunoreactive metabolites corresponding to radiolabelled metabolites in both sexes. The physiological and biological relevance of the epiandrosterone EIA was validated by demonstrating (1) a significant increase in fTM concentrations after a testosterone challenge test, (2) a lack of crossreactivities with faecal glucocorticoid metabolites (fGM), and (3) significant differences in fTM levels in juvenile males and adult males of a free-ranging population. In Article 2, we validated an epiandrosterone EIA for male cheetahs by performing a testosterone radiometabolism study followed by high-performance liquid chromatography (HPLC) analyses and excluding possible crossreactivities with fGM. The physiological and biological relevance of the epiandrosterone EIA was validated by demonstrating (1) a significant increase in fTM concentrations after a testosterone injection, (2) a significant increase in fTM concentrations after a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) injection, and (3) significant differences in fTM concentrations in adult male, adult female and juvenile male cheetahs of a free-ranging population. InArticle3, we highlight the challenge of undesired cross-reactivities of testosterone EIAs to unknown fGM. For this purpose, we compared the ability of four different testosterone EIAs to monitor gonadal activity in spotted hyenas non-invasively based on fTM analyses. Our study demonstrates that a careful methodological and biological validation is requested to ensure that fTM concentrations quantitatively reflect gonadal activity. Even for an EIA passed the biological validation based on a challenge experiment, it is highly recommended to ensure that stress-related increases in fGM are not monitored whenapplying an assay for fTM quantification. Our studies describe the first EIAs for the non-invasive monitoring of testosterone and its underlying endocrine mechanisms, thereby providing the necessary tools for long-term investigations of hormone-behaviour relationships in both carnivore species.

Die Entwicklung von Enzymimmunoassays (EIAs) zur Bestimmung fäkaler Testosteronmetaboliten (fTM) ermöglicht ein nicht-invasives Studiendesign zur Beurteilung des gonadalen Staus eines Tieres ohne die Notwendigkeit der Blutentnahme. Trotz der weitverbreiteten Anwendung dieser Techniken müssen EIAs sorgfältig für jede Spezies und jedes Hormon validiert werden. Ziel der vorliegenden Dissertation war die Etablierung und Validierung von EIAs zur Beurteilung der Gonadenaktivität in zwei Raubtierspezies, der Tüpfelhyäne (Crocuta crocuta) und dem Geparden (Acinonyx jubatus), anhand fäkaler Hormonanalysen. In Artikel 1 beschreibe ich die Validierung eines Epiandrosteron-EIAs für die Messung von fTM in Tüpfelhyänen. Wir haben Radiometabolismusstudien in jeweils einem gefangen-gehaltenen Männchen und Weibchen durchgeführt, um die ausgeschiedenen fTM zu charakterisieren. Für beide Geschlechter wurde gezeigt, dass der Epiandrosteron-EIA immunreaktive Testosteronmetaboliten detektiert, die mit den Elutionspositionen radioaktiv- markierter Metaboliten korrespondieren. Die physiologische und biologische Bedeutung des Epiandrosteron-EIAs konnte durch (1) einen signifikanten Anstieg in fTM Konzentrationen nach Testosteroninjektion,(2) fehlender Kreuzreaktivitäten mit fäkalen Glucocorticoidmetaboliten (fGM), und (3) signifikanten Unterschieden in fTM Konzentrationen juveniler und adulter Männchen einer freilebenden Population nachgewiesen werden. In Artikel 2 haben wir einen Epiandrosteron-EIA für männliche Geparden validiert. Dazu haben wir eine Testosteronradiometabolismusstudie und anschließende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analysen durchgeführt, um Kreuzreaktivitäten mit fGM ausschließen. Die physiologische und biologische Bedeutung des Epiandrosteron-EIAs konnte durch (1) einen signifikanten Anstieg der fTM Konzentrationen nach Testosteroninjektion, (2) einen signifikanten Anstieg der fTM Konzentrationen nach GnRH-Injektion, und (3) signifikanten Unterschieden in fTM Konzentrationen adulter und juveniler Geparden einer freilebenden Population nachgewiesen werden. In Artikel 3 beleuchten wir die Problematik ungewünschter Kreuzreaktivitäten von Testosteron-EIAs mit unbekannten fGM. Dazu wurde die Eignung von vier Testosteron-EIAs zum nicht- invasiven Monitoring der Gonadenaktivität in Tüpfelhyänen verglichen. Unsere Studie zeigt, dass eine sorgfältige methodische und biologische Validierung nötig ist, um sicherzustellen, dass fTM Konzentrationen quantitativ die Gonadenaktivität widerspiegeln. Auch wenn ein EIA die biologische Validierung besteht, ist es ratsam sicherzustellen, dass stressbedingte Anstiege in fGM nicht von einem Assay für die fTM Quantifizierung mitgemessen werden. Unsere Studien beschreiben die ersten EIAs für das nicht-invasive Testosteronmonitoring und der zu Grunde liegenden endokrinen Mechanismen, und stellen damit die notwendigen Instrumente für Langzeituntersuchungen von Hormon-Verhaltensbeziehungen in beiden Raubtierspezies dar.