Neue Aspekte zu Validität und Wertigkeit der postmortalen Testung relevanter Infektionsparameter bei Gewebespendern

Abstract

Das Hauptrisiko im Rahmen von Gewebetransplantationen besteht in der potenziellen Übertragung klinisch relevanter Infektionserreger. Zur weiteren Minimierung dieses Restrisikos hat sich im Tissue Banking ein aus der Transfusionsmedizin abgeleitetes Sicherheitsstufenkonzept etabliert und umfasst gesetzlich vorgeschriebene Qualitätskriterien für Spenderauswahl, Labortestung, Gewebegewinnung und - verarbeitung, mikrobiologische Inaktivierungsverfahren und Qualitätssicherung. Dieses Konzept kann nicht unverändert von Lebend- auf Leichenspender übertragen werden, da die relevanten Untersuchungen bei Lebendspendern ausschließlich aus frischen Blutproben durchgeführt werden. Dementsprechend sind die im Blutspendewesen verwendeten infektionsserologischen bzw. Nukleinsäure-Amplifikations-Technik (NAT)-Teste nur für prämortale aber nicht für postmortale Proben validiert und lizenziert. Bei Leichenspendern muss jedoch häufig postmortales Blut getestet werden, insbesondere dann, wenn es sich nicht um Multiorganspender handelt (z.B. Spender aus Rechts-medizinischen Instituten) oder wenn keine frischen (<7 Tage) prämortalen Blutproben verfügbar sind. Die Ergebnisse vereinzelter Studien in diesem Zusammenhang sind widersprüchlich und erlauben keine Schlussfolgerungen. Insofern sind die Themen der Vergleichbarkeit prä- und postmortaler Probentestung, der Entwicklung von Algorithmen zur Validierung aus postmortalem Blut und Untersuchungen zur Stabilität von Antigenen und Antikörpern für HIV, HBV und HCV in Leichenblut von ho-hem wissenschaftlichem und klinischem Interesse. Die Schwerpunkte dieser Arbeit umfassen folgende Fragestellungen: Gibt es Unterschiede zwischen der prä- und postmortalen Infektionstestung aus Blutproben desselben Gewebespenders? Wie kann eine Validierung von infektionsserologischen Testsystemen für postmortale Blutproben durchgeführt werden? und Ist der sichere Nachweis von Anti-HIV 1/2, HBsAg, Anti-HBc und/oder Anti-HCV aus Blutproben von potenziell infektiösen Spendern bis zu 48 Stunden postmortal möglich? Im ersten Teilprojekt der hier vorgelegten Arbeit wurde bei 487 Hornhautspendern eine Ü-bereinstimmung der infektionsserologischen Testergebnisse auf Anti-HIV 1/2, HBsAg, Anti-HBc und Anti-HCV zwischen prä- und postmortalen Proben in 95,7% ermittelt. Es kam ins- gesamt bei 21 Fällen zu Diskrepanzen (4,3%). Bei 17 (3,5%) postmortalen Proben waren die Ergebnisse falsch positiv und bei 4 (0,8%) falsch negativ. Im zweiten Teilprojekt wurde eine prospektive Untersuchung des Verlaufs serologischer Pa-rameter für HIV-, HBV- und HCV-Infektionen bei 30 kühl gelagerten Verstorbenen mit diesen Infektionskrankheiten bis zu 48 Stunden postmortem (0, 12, 24, 36, 48 Std.) vorgenommen. Mit dieser erstmals durchgeführten Studie konnte bei allen untersuchten Parametern eine Antigen- bzw. Antikörperstabilität bis zu 48 Stunden postmortem nachgewiesen werden. Im dritten Teilprojekt wurden 20 postmortale Blutproben von Augenhornhautspendern in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (Iow/high) mit definierten PEI/WHO- Standards für Anti-HIV 1/2, HBsAg, Anti-HBc und Anti-HCV gespikt und unter Mitführung einer Negativkontrolle am BEP-Ill-Laborautomaten (Siemens) untersucht. Im Ergebnis wurden alle ungespikten Proben richtig negativ und alle gespikten Proben richtig positiv bestimmt. Bei der unter vergleichbarer Logistik durchgeführten Untersuchung auf Treponema pallidum wurden in zwei Fällen falsch positive Ergebnisse ermittelt. Beide Proben waren makroskopisch auffällig und stark hämolytisch. Schließlich wurde auch der Genomnachweis für HIV, HBV, HCV und HAV unter Verwendung von PEI-Standards validiert. Es konnten für sämtliche untersuchten Viren in allen Proben richtige Ergebnisse ermittelt werden. Ein Einfluss der p.m. Entnahmezeit oder einer Hämolyse auf die Messergebnisse zeigte sich nicht. Mit den vorgestellten Studien konnten wir aufzeigen, dass Infektionen mit HIV, HBV, HCV und Treponema pallidum aus p.m. Blut bis zu zwei Tagen postmortem valide detektiert wer-den. Dabei können falsch positive und falsch negative Ergebnisse durch optimierte präanalytische Vorgehensweisen weitgehend verhindert werden.

The transmission of viral and non-viral infectious pathogens continues to be the most serious of the potential adverse effects of allogenic tissue transplantations. The EU directive 2006/17/EC stipulates that cadaveric blood specimens for serology testing in the context of post-mortal tissue donation must be taken not later than 24 hours post-mortem. An expanded time slot would significantly improve availability of tissue donations, but there are no significant data on the stability of infectious serology assays for anti-HIV, anti-HCV, HBsAg and anti-HBc in samples collected more than 24 hours post- mortem. Post-mortem modifications might give false negative or false positive results in infectious disease testing due to hemoly-sis, autolysis and bacterial growth. Most CE-marked test equipments for infectious serology testing are not validated for testing post-mortal blood. Up to now no study compares the re-sults of infection testing in pre-mortal and post-mortal samples of the same donors. Our thematic priority was the comparison of infectious testing of pre- and postmortem blood samples and investigations in the methodology that may be used as guidance for validation of serological infection diagnosis of post-mortem blood samples. In a first study pre- and postmortem findings from the same cornea donors of the University Tissue Bank of the Charité in the years 2004-2009 (n = 487) were retrospectively analyzed and compared. The test results from pre-mortem blood samples were defined as the refer-ence for the post-mortem blood test. Of 487 cornea donors, there were a total of 21 cases (4.3%) with discrepancies between serological test results from pre- and post-mortem blood samples. Of these, false negative results within post-mortem serology occurred in 4 of 487 cases (0.8%), false positive results within the post-mortem blood samples occurred at a much more frequent rate, with 17 of 487 cases (3.5%). In a second prospective study, serum samples of 30 deceased persons were taken upon admission to the Institute of Forensic Medicine, and after a further 12, 24, 36 and 48 hours post-mortem. All samples were measured twice. First, using the Abbott Axsym® system, and on average, after 9-month storage at -70°C using the BEP- III®-System with Siemens and Ortho reagents. All samples (0, 12, 24, 36, 48 h) were reactive. Indeterminate or false nega-tive results did not occur. In a third study negative postmortem sera were spiked with standard sera (PEI/WHO) for Anti-HIV 1/2, HBsAg, Anti-HBc und Anti-HCV in concentrations which give low and high posi-tive results for the respective marker. None of the postmortem samples was false positive. None of the spiked post-mortem samples was false negative. The testing for Anti-Treponema pallidum was performed with postmortem sera, which were spiked with anti-Treponema pallidum-positive standard sera in concentrations which give low and high positive results at the respective dilution. Two of the unspiked postmortem sera were false positive most likely due to intense hemolysis. None of the spiked samples were false negative after 0, 24 and 60 hours, respectively. Similarly to serological testing commercial available NAT systems are usually not validated for screening of post mortem blood samples. We spiked post mortem serum and plasma samples from cornea donors and control samples from blood donors, serologically and NAT negative for all investigated parameters, with defined concentrations of WHO reference material and tested for HIV-1, HCV, HBV and HAV by NAT using DRK Baden-Würtemberg-Hessen CE PCR kits. The analytical sensitivity was 100% for control and post mortem specimens when spiked with virus standards at concentrations of 3 x level of detection (LOD). Invalid results did not occured. The analytical specificity rate for all assays was 100%. Based on the presented validations post mortem donor samples can be tested valid for for infectious deseases up to a minimum of 48 hours postmortem. The methodologies described in the studies may be used as guidance for validation of serological testing in postmortem blood samples.