Die Rolle der Mitochondrien in der Genese von Herzalternans und der Einfluss der Überexpression von Serca2a in Mauskardiomyozyten

Abstract

Obwohl der plötzliche Herztod zu den häufigsten Todesursachen der westlichen Länder zählt, sind die Zusammenhänge, die zu seiner Entwicklung führen, wenig verstanden. Als ein zelluläres Korrelat für die elektrische Instabilität der Repolarisation des Herzens, spielt Alternans eine Rolle bei der Entwicklung von Arrhythmien. Neben einer reduzierten Ejektionsfraktion und weiteren Parametern sind Alternans der T-Welle ein anerkannter Risikofaktor für das Auftreten eines plötzlichen Herztodes. Der Begriff Herzalternans beschreibt u.a. auch eine Veränderung des Calciumtransienten, die als charakteristisches ABAB-Muster auftritt. Calcium ist das wichtigste Ion für die Funktion des Herzens. Die Serca2a-ATPase pumpt Calcium in der Diastole zurück in das Sarkoplasmatische Retikulum. Mitochondrien spielen zudem eine signifikante Rolle in der Calciumhomöostase. Hieraus resultiert die Überlegung, ob eine Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien einen Einfluss auf die Genese von Herzalternans hat und wie sich eine Überexpression der Serca2a auf Alternans auswirkt. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode angewendet, die es erlaubt mittels Fluoreszenzmikroskopie Calciumtransienten in zwei Kompartimenten der Zelle gleichzeitig darzustellen. Es wurden Kardiomyozyten von Kontroll-Mäusen sowie transgenen Serca2a-überexprimierten Mäusen isoliert und mit Calciumfluoreszenzmarkern geladen. Die Beladungungskonditionen der Calciumindikatoren mussten ermittelt und die Lokalisation bewiesen werden. Der Calciuminhalt von Kontroll- und Serca2a-Zellen wurde verglichen. Dann wurde Herzalternans erzeugt und das Verhalten bei der Zugabe von Inhibitoren der Mitochondrienfunktion beobachtet. Zur Beurteilung vor und nach Applikation wurden Alternansratio errechnet. Außerdem wurde geprüft, ob die Veränderungen reversibel sind und eine Überführung von Alternans zu normalen Calciumtransienten gelingt. Durch die pharmakologische Blockierung spezifischer Funktionen von Mitochondrien wurde Alternans im Zytosol und Mitochondrien verstärkt. Die folgenden Beobachtungen bestätigten die Hypothese, dass Serca2a eine kardioprotektive Wirkung hat, die auf Zellebene erklärt werden kann: Veränderungen der Alternansratio in den Serca2a-Zellen nach Exposition mit Chemikalien waren geringer als in Kontroll-Zellen, und Serca2a-Zellen zeigten eine schnellere Erholung. Außerdem konnte festgestellt werden, dass es in Kardiomyozyten, welche zuvor mit einer oxidierenden Chemikalie behandelt wurden, nach der Supplementation mit einem Antioxidans, teilweise zur Normalisierung von Alternans kam. Diese Arbeit beschreibt zum ersten Mal das simultane Auftreten von Herzalternans im Zytosol und Mitochondrien in Mauskardiomyozyten. Die Hauptaussage dieser Studie ist, dass die Beeinträchtigung der mitochondrialen Calciumhomöostase und Energieproduktion zu einer Verschlechterung von Herzalternans in beiden Kompartimenten führt und, dass diese Veränderungen bei Überexpression von Serca2a kleiner ausfallen. Es konnte bestätigt werden, dass die Überexpression der Serca2a zu einer verringerten Anfälligkeit für elektrische Instabilität bei metabolisch gestressten Kardiomyozyten führt. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Schweregrad von Alternans moduliert werden kann. Das demonstriert einen Zusammenhang zwischen Alternans, sarkoplasmatischem Calciuminhalt, mitochondrialer Dysfunktion und trägt zum Verständnis von Veränderungen der Calciumhomöostase auf Zellebene bei.

Cardiac alternans stands for a wide range of physiologic and pathologic conditions, such as an increased risk for ventricular and atrial arrhythmias and, as a sign for electrical instability, is a strong marker of sudden cardiac death besides others, such as reduced ejection fraction and electrocardiographic parameters. At the cellular level, alternans describes the beat-to-beat variation in calcium transient. Calcium is the most important ion for the function of the heart and mitochondria play a significant role in calcium signaling. The aim of this study was to investigate the effect of impaired mitochondrial function in the genesis of alternans and to establish a nouvelle technique to further understand how mishandling of calcium leads to pathologic conditions. Cardiomyocytes were freshly isolated from control and transgenic Serca2a upregulated mice. The same cell solution was loaded with two different calcium indicators to enhance the accumulation in the mitochondria and the cytosol, measured with a custom-made Fluorescence System. Alternans was elicited by field stimulation. Once stable alternans was established, the superfusing solution was switched to a chemical influencing mitochondrial metabolism and calcium cycling. Based on this method we altered different calcium pathways and examined their effect on alternans. We blocked complex I and II, cytochrome c oxidase, F0F1- synthase, α-ketoglutarate dehydrogenase of the electron transport chain, inhibited calcium uptake via mitochondrial calcium uniporter and exposed cells to an oxidizing agent. Every intervention increased alternans in the cytosol and mitochondria in a specific range. Changes in Serca2a mice, that had higher sarcoplasmic calcium content, were always less severe than those observed in control mice during exposure with the chemical. We next examined if the observed changes of alternans are reversible using agonists of mitochondrial function. This study presents the first simultaneous description of cardiac alternans in the cytosol and mitochondria observed in cardiomyocytes of control as well as in Serca2a mice hearts. The major findings of this study are that the impairment of mitochondrial calcium cycling and energy production leads to a higher alternans ratio in both control and Serca2a mice but changes in Serca2a mice are less severe, indicating that Serca2a mice are more capable to sustain electrical stability also during stress. Moreover it was possible to partly rescue alternans. This demonstrates a relationship between alternans, sarcoplasmic calcium content and mitochondrial dysfunction, which will help to understand the changes in calcium signaling in myocytes from patients with heart diseases, leading to new targets for therapeutic interactions.