Gene targeting and single-cell electroporation to analyze cholinergic neurons using choline acetyltransferase as marker

Abstract

Cholinergic neurons use the neurotransmitter acetylcholine (ACh) and are involved in basic brain functions like learning and memory formation, awareness, the sleep and awaking cycle as well as motor behavior. Cholinergic neuron loss occurs during severe neurodegenerative diseases like Alzheimer or amyotrophic lateral sklerosis. So far immunohistochemistry or in situ hybridization against the cholinergic marker enzyme choline acetyltransferase (ChAT) serve to identify cholinergic neurons. However, these methods require fixation of the tissue and thus preclude in vivo experiments. One aim of the present work was to produce a fusion protein between ChAT and the green fluorescent protein (GFP) which will enable to visualize the cholinergic marker without fixation. Therefore the cDNA of ChAT was isolated from mouse spinal cord and subsequently the cDNA of GFP was cloned into a unique HindIII restriction site corresponding to the N-terminal part of the ChAT protein. The ChAT-GFP protein was expressed in COS-1 cells and primary cultures of hippocampal neurons as well as in hippocampal neurons of organotypic brain slice cultures. It was shown that the enzyme activity of the recombinant ChAT- GFP fusion protein is slightly reduced compared to the wildtype enzyme. However, it is still functional and similar distributed as the wildtype protein in cultured cells. In hippocampal neurons ChAT-GFP translocates into axonal processes and it is present in the presynaptic compartments. Since it was shown that ChAT-GFP is functional like the wildtype enzyme the cDNA of GFP was targeted to the ChAT gene of mouse embryonic stem cells by homologous recombination. These ChAT(GFP/+) ES cells were injected into blastozysts to produce chimeric mice. This blastozyst transfer provided 14 chimeric animals. Hetero- and homozygous mice which emerge from ChAT(GFP/+) ES cells will express the ChAT-GFP fusion protein in all cholinergic cells and hence these cholinergic neurons should show endogenous fluorescence. In parallel another ES cell clone was produced in which the first coding exon of ChAT is flanked by loxP sites (genotype ChAT(loxP/+)). This "knock-out" model will allow the conditional deletion of the ChAT gene specifically in the cholinergic nervous system during later developmental stages. A further aim was to establish organotypic brain slice cultures in order to study the physiology, development and degeneration of cholinergic neurons. With cultures prepared from ChAT-GFP targeted mice it will be possible to transfect cholinergic neurons. To this end a new method for electroporation of individual neurons, namely single-cell electroporation (SCE), was established and the efficiency of SCE was significantly improved. Using SCE, neuronal markers were expressed as GFP- fusion proteins in pyramidal neurons of organotypic hippocampal brain slice cultures and their distribution was compared with that of ChAT-GFP. It was shown that ChAT-GFP is present in the cytosol of the soma, dendritic spines and the axon but is absent from the nucleus and is at least in part associated with synaptic vesicles. The combination of gene targeting by homologous recombination and the direct gene transfer by SCE opens new avenues to analyze signal transduction in the cholinergic system at a molecular level.

Cholinerge Neuronen benutzen den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) und sind an fundamentalen Gehirnfunktionen wie dem Lernen und Erinnern, Bewusstsein, dem Schlaf-Wach-Rhythmus wie auch der Muskelkontrolle beteiligt. Bei schweren neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer oder Amyotropher Lateral Sklerose gehen cholinerge Nervenzellen verloren. Zur Identifikation cholinerger Neuronen setzt man immunhistochemische Methoden oder in situ Hybridisierung gegen das cholinerge Markerenzym Cholin Acetyltransferase (ChAT) ein. Diese Methoden erfordern allerdings die Fixierung des Gewebes, wodurch es nicht möglich ist, in vivo Experimente durchzuführen. Ein Ziel dieser Arbeit war, durch die Herstellung eines ChAT Fusionsproteins mit dem grün fluoreszierende Protein (GFP) zu ermöglichen, cholinerge Neuronen ohne Fixierung sichtbar zu machen. Hierfür wurde die cDNA von ChAT aus dem Rückenmark der Maus isoliert und nachfolgend die cDNA von GFP in eine einzelne HindIII Restriktionsschnittstelle kloniert, einem Sequenzbereich, der dem N-terminalen Ende des ChAT Proteins entspricht. Dieses ChAT-GFP Fusionsprotein wurde in COS-1 Zellen und Primärkultur hippokampaler Neuronen sowie in hippokampalen Neuronen organotypischer Gehirnschnittkulturen exprimiert. Es wurde gezeigt, dass das rekombinante ChAT-GFP Fusionsprotein eine geringfügig niedrigere spezifische Aktivität gegenüber dem Wildtypenzym besitzt. Es ist jedoch funktional und in Kulturzellen genauso wie das Wildtypprotein verteilt. In hippokampalen Neuronen diffundiert ChAT-GFP in axonale Verzweigungen und gelangt so an seinen Wirkungsort, die Präsynapse. Nachdem gezeigt wurde, dass ChAT-GFP in seiner Funktion vergleichbar dem Wildtypenzym ist, wurde die cDNA von GFP durch homologe Rekombination gezielt in das ChAT Gen embryonaler Stammzellen der Maus integriert. Diese ChAT(GFP/+) ES-Zellen wurden in Blastozysten injiziert. Aus diesem Blastozystentransfer gingen 14 chimäre Tiere hervor. Hetero- und homozygote Tiere, die aus ChAT(GFP/+) Stammzellen hervorgehen, werden das zuvor beschriebene ChAT-GFP Fusionsprotein in allen cholinergen Zellen exprimieren welche folglich eine endogene Fluoreszenz zeigen sollten. Parallel dazu wurde ein weiterer ES Zellklon hergestellt, bei dem das erste kodierende Exon von ChAT ?gefloxt" ist (Genotyp ChAT(loxP/+)). Durch konditionalen ?Knockout" kann dann das ChAT Gen entwicklungs- und gewebespezifisch in Mäusen ausgeschaltet werden. Ein weiteres Ziel war, die Kultivierung von organotypischen Gehirngewebeschnitten zu etablieren um später die Physiologie, Entwicklung und Degeneration cholinerger Neuronen untersuchen zu können. Dies soll u.a. durch gezielte Transfektion von cholinergen Neuronen in Gewebekultur erreicht werden. Aus diesem Grund wurde eine neue Methode, ?single-cell electroporation" oder SCE, zur Elektroporation von einzelnen Neuronen etabliert. Die Effizienz dieser Methode wurde um ein Vielfaches gesteigert. Mit SCE wurden neuronale Markerproteine in Pyramidenneuronen organotypischer, hippokampaler Gehirnschnitte exprimiert und mit der Verteilung von ChAT-GFP verglichen. Es wurde gezeigt, dass ChAT-GFP im Zytosol des Zellsomas, der dendritischen Spines und des Axons vorkommt und zumindest teilweise mit synaptischen Vesikeln assoziiert ist. Die Kombination aus genetischer Modifikation durch homologe Rekombination und direktem Gentransfer durch SCE ermöglicht neue Wege, die Signaltransduktion des cholinergen Systems auf molekularer Ebene zu analysieren.