microRNA-155 und -146a: Expressionsanalyse in der Kolonmukosa von Morbus Crohn- und Colitis Ulzerosa-Patienten und Einfluss der Überexpression auf die Epithelbarriere im Zellkulturmodell

Abstract

The pathogenesis of the chronic inflammatory bowel diseases (IBD), Crohn's disease (MC) and Ulcerative colitis (CU) is currently unclear, multifactorial triggers are suspected. Both MC and CU are associated with diarrhea and a severe inflammation of parts of the gastrointestinal tract. One reason for the diarrhea is a barrier disorder of the intestinal epithelium, characterized by an altered composition of Tight Junction (TJ) proteins that connect intestinal cells. microRNAs (miRs) could have an influence on the course of IBD, as differences in their expression-levels between IBD and healthy patients could be determined. In mouse- and cell culture- experiments, the effects of several miRs on protein expression and intestinal barrier properties have already been proven. In this work it was investigated whether an enhanced mucosal expression of miR-155 and miR-146a depends on the mucosal inflammation in IBD patients and whether an increased expression of these two miRs has an influence on the epithelial barrier properties. First, the expression-levels of miR-155 and miR-146a in human colon specimens obtained from surgical resections and biopsies were determined. It was found that miR-155 was increased in both MC and UC in inflamed colonic mucosa compared with healthy controls. In non-inflamed mucosa, there was no expression-change, underlining the assumption that miR-155 could be involved in inflammatory processes. An increased expression of miR-146a, however, was only detected in inflamed mucosal areas of CU, but not in inflamed areas of MC. In order to investigate whether miR-155 and miR-146a might be responsible for alterations of the intestinal barrier associated with IBD, miR-155- and miR-146a-overexpression clones of the human colon carcinoma cell line HT29/B6 were examined in an epithelial cell culture model. Measurements of the transepithelial resistance (TER), an indicator for barrier integrity, of an epithelial cellmonolayer, showed no differences between overexpression clones and vectorcontrol. After lysing the cells, the expression of two barrier-relevant TJ-proteins claudin-1 and -2 were determined by means of Western blot. Here, too, no difference between overexpression clones and vectorcontrol were found. In conclusion, it can be assumed that the expression-increase of miR-155, and possibly also miR-146a, takes place depending on the inflammation in the colonic mucosa. The results of the in-vitro cell culture studies did not point on an immediate influence of miR-155 or miR-146a on the epithelial barrier function.

Die Pathogenese der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus Crohn (MC) und Colitis Ulzerosa (CU) ist bis heute unklar, es werden multifaktorielle Krankheitsauslöser vermutet. Sowohl MC als auch CU gehen mit Diarrhöen und einer schweren Inflammation einzelner Abschnitte oder des gesamten Gastrointestinaltraktes einher. Es liegt eine Barrierestörung des Darmepithels vor, die unter anderem durch eine veränderte Proteinexpression und Komplexität der Tight Junction (TJ)-Proteine charakterisiert ist. In den letzten Jahren zeigte sich, dass microRNAs (miRs) Einfluss auf das Krankheitsgeschehen der CED haben könnten, da für zahlreiche miRs Expressionsunterschiede zwischen gesunden und an CED erkrankten Patienten nachgewiesen werden konnten. In Maus- und Zellkulturversuchen konnten bereits Einflüsse von zahlreichen miRs auf Proteinexpression und Darmbarriereeigenschaften gefunden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob miR-155 und miR-146a in Abhängigkeit der mukosalen Entzündung bei CED-Patienten verändert exprimiert werden und ob eine gesteigerte Expression dieser beiden miRs einen Einfluss auf die epitheliale Barrierefunktion hat. Zunächst wurden die Expressionslevel von miR-155 und miR-146a in humaner Kolonmukosa, die aus Operationsresektaten und Biopsien gewonnen wurde, bestimmt. Es zeigte sich, dass miR-155 sowohl bei MC als auch bei CU in entzündeter Mukosa im Vergleich zu gesunden Kontrollen verstärkt exprimiert wird. In nicht-entzündeter Kolonmukosa zeigte sich keine veränderte Expression, was die Vermutung unterstreicht, das miR-155 an inflammatorischen Prozessen beteiligt sein könnte. Eine verstärkte Expression der miR-146a dagegen wurde nur in entzündeter Kolonmukosa von CU, nicht dagegen in entzündeten MC-Arealen, nachgewiesen. Um zu untersuchen, ob die beiden genannten miRs ursächlich für die mit CED assoziierten Störungen der intestinalen Barrierefunktion und somit auch für Krankheitssymptome verantwortlich sein könnten, wurden miR-155- und miR-146a-Überexpressionsklone der humanen Kolonkarzinomzelllinie (HT29/B6) in einem epithelialen Zellkulturmodell untersucht. Messungen des transepithelialen Widerstandes (TER) über einem Filterinsert mit darauf kultivierten epithelialen Zellmonolayern zeigten keine Unterschiede zwischen Überexpressionsklonen und Vektorkontrolle. Der TER ist ein Maß für die Barriereintegrität und lässt Rückschlüsse auf die Barrierefunktion zu. Nach Lyse der Zellen wurde ferner die Expression der barriererelevanten TJ-Proteine Claudin-1 und -2 mittels Western Blot untersucht. Auch hier zeigte sich kein Unterschied zwischen Überexpressionsklonen und Vektorkontrolle. Somit konnten keine Hinweise dafür gefunden werden, dass die untersuchten miRs einen direkten Einfluss auf die Epithelbarriere nehmen. In der Zusammenschau der gewonnenen Erkenntnisse kann vermutet werden, dass die Expressionszunahme der miR-155, und möglicherweise auch die der miR-146a, in Abhängigkeit der Entzündung in der Kolonmukosa erfolgt. Die Ergebnisse der in-vitro-Versuche am Zellmodell sprechen gegen einen direkten Einfluss der beiden miRs auf die Barrierefunktion.