Non-coding RNA expression profiling of B-cell malignant (non-Hodgkin) lymphomas

Abstract

MicroRNAs are small (20-23nt in length), non-coding and highly conserved molecules, which are involved in several regulatory processes like cell growth, proliferation, differentiation, immune response and apoptosis, and play important roles in several diseases, including cancers like lymphoma. Germinal center (GC) derived B-cell lymphomas, including Burkitt lymphoma (BL), diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and follicular lymphoma (FL), are the most frequent malignant lymphomas. Although clear distinctions on histologic and genetic grounds exist, there are also a large number of cases with intermediate features, not unequivocally attributable to one of these entities. The ICGC-MMML-Seq Consortium aims at fully characterizing a total of 250 GC derived B-cell lymphomas. Here we generated miRNA profiles from 56 patient samples including BL, DLBCL and FL using Illumina technology. Over the past decade, many studies have attempted to distinguish lymphoma subtypes using miRNAs profiling. However, available data is preliminary, as published profiles are not derived from large sample collections and also originate mostly from PCR-based approaches and microarrays. Yet, only sequencing-based approaches allow for an unbiased analysis and the discovery of novel miRNAs and small RNA classes. Our initial differential expression analyses comparing BL against non-BL showed eight miRNAs to be differentially expressed. In addition, we analyzed miRNA deregulation between non-BL subtypes including FL and DLBCL and also compared each of them separately to BL. A signature of 87, 98 and 108 miRNAs was obtained that differentiated FL from DLBCL, BL from DLBCL and BL from FL, respectively. Mutational analysis identified 17 mutations in 12 patients corresponding to eight distinct miRNAs. Among eight mutated miRNAs, miR-142 with a total of seven different mutations in six patients was the most frequently mutated miRNA. Among predicted novel miRNAs, we successfully validated four candidates by Northern Blot experiments and we then tried to uncover their function in lymphomagenesis by performing further functional studies. In addition, our data gave insight into the role of lncRNAs in GCB-lymphomas. We found the differential expression as well as differential methylation pattern of the lncRNA AP000251 in GCB-lymphoma subtypes. To investigate which miRNA-target pairs are more likely to display regulation in lymphoma, we performed AGO2-PAR-CLIP in four lymphoma (Raji, NAMALWA, SU-DHL-4 and SU-DHL-6) cell lines. We identified putative miRNA- targets from each PAR-CLIP library which might represent a helpful tool to find potential therapeutic targets and prognostic markers in lymphoma.

MicroRNAs sind kurze (20-23 Nukleotide lange), nicht-kodierende und hoch konservierte Moleküle, die an vielen regulatorischen Prozessen wie z.B. Zellwachstum, Proliferation, Differenzierung, Immunantwort und Apoptose beteiligt sind. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle in zahlreichen Krankheiten, u.a. in verschiedenen Krebsarten wie z.B. Lymphomen. Keimzentrums-B-Zell-Lymphome, zu denen Burkitt-Lymphome (BL), diffus großzellige B-Zell-Lymphome (DLBCL) und follikuläre Lymphome (FL) zählen, stellen die häufigsten aggressiven Lymphome dar. Und auch wenn prinzipiell eindeutige histologische und genetische Unterscheidungskriterien beschrieben wurden, existieren in der täglichen Praxis doch zahlreiche Fälle mit intermediärem Phänotyp, die sich nicht eindeutig in eine der o.g. Kategorien einordnen lassen. Das ICGC-MMML-Seq Konsortium hat sich die vollständige Charakterisierung von 250 Keimzentrums-B-Zell-Lymphomen zum Ziel gesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden miRNA Profile von 56 Patientenproben (zusammengesetzt aus BL, DLBCL und FL) mit Illumina Technology sequenziert. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Studien versucht, die Lymphomsubtypen an Hand von miRNA Profilen zu unterscheiden. Die in diesem Rahmen generierten Daten sind jedoch insoweit nur als vorläufig zu betrachten, da sie zum einen nicht aus großen Patientenkollektiven rekrutiert wurden und zum anderen auf PCR-basierenden Methoden zurückgehen. Nur eine auf den neuen Sequenziertechniken beruhende Herangehensweise erlaubt jedoch die unverzerrte Analyse und die Möglichkeit, sowohl neue miRNAs als auch neue Klassen kleiner RNAs zu entdecken. Im ersten Schritt wurden Burkitt-Lymphome mit nicht- Burkitt-Lymphome verglichen, dort zeigte sich die differentielle Expression von acht miRNAs. Zusätzlich wurde die miRNA Deregulation zwischen FL und DLBCL sowie auch jeweils individuell gegen BL analysiert. So konnten Expressionssignaturen beschrieben werden, die FL von DLBCL (87 miRNAs), BL von DLBCL (98 miRNAs) und BL von FL (108 miRNAs) unterscheiden. In der Mutationsanalyse basierend auf 12 Patientendatensätzen wurden 17 Mutationen, die acht verschiedene miRNAs betrafen, gefunden. Am häufigsten war miRNA-142 mit insgesamt sieben Mutationen in sechs Patienten betroffen. Unter allen bioinformatisch vorhergesagten neuen miRNAs konnten vier Kandidaten durch Northern Blot Experimente validiert werden. Anschließend wurde damit begonnen, deren Rolle in der Lymphomentstehung durch funktionelle Studien näher zu charakterisieren. Darüber hinaus gewährend die Sequenzierdaten Einblicke in die Rolle von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs). So konnte z.B. ein differentielles Methylierungs- und Expressionsmuster der lncRNA AP000251 beschrieben werden. Um zu klären, welche miRNA-mRNA Regulationspaare eine relevante Aufgabe in Lymphomen übernehmen, wurden AGO2-PAR-CLIP Experimente in vier Lymphomzelllinien (Raji, NAMALWA, SU-DHL-4, SU-DHL-6) durchgeführt. Die identifizierten mRNAs, die eine validierte Regulation durch miRNAs zeigen, können nun als Ausgangspunkt dienen, um mögliche therapeutisch nutzbare Strukturen sowie prognostische Marker in Lymphomen zu beschreiben.